一种检测日本毛刺线虫的引物组及其应用的制作方法

本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种检测日本毛刺线虫的引物组及其应用。

背景技术：

毛刺线虫是植物根际重要的植物寄生线虫，寄生植物的根部，影响根系生长，甚至造成根部生长停滞，导致植物根系粗短。属内的许多种还是一些植物病毒的传播介体，对许多经济作物如花卉、果树等都造成严重的经济损失，世界上许多国家地区均将此类线虫列为禁止进境的检疫性有害生物。毛刺线虫属（传毒种类）被列入国家质检总局颁布的《关于实施进口罗汉松植物检疫措施公告有关事项的通知》（国质检动函〔2011〕88号）中进口日本大型景观植物重点关注的有害生物名单，属于检疫性有害生物。

日本毛刺线虫（Trichodorus japonicus Zhao, Xie, Gu & Xu, 2013）已在日本千叶、鹿儿岛、东京都的鸡爪槭、山茶花、罗汉松、紫薇等寄主多次截获，截获的频率高于雪松毛刺线虫，属于日本苗木根际线虫的优势种群。近年来我国从日本进口大量的种苗，日本毛刺线虫传入我国的风险很高。日本毛刺线虫是2013年从进境植物根际发现的新种，具有潜在的传毒能力。雪松毛刺线虫一直被国际毛刺专家怀疑是复合种，赵立荣发现的日本毛刺线虫就是该复合种中的隐种，并且很有可能文献报道的日本分布的雪松毛刺线虫大部分是日本毛刺线虫。据文献报道，雪松毛刺线虫引起日本的松树等苗圃黄化、萎蔫等症状，严重影响苗圃的种植。所以，日本毛刺线虫的危害应引起关注。

日本毛刺线虫与雪松毛刺线虫形态难区分，两者的区别主要在雌虫（腹面观）阴门形状、交合伞的有无；阴门孔状和横裂的的形状很难辨别，其形状又受固定液、体态等因素影响；毛刺线虫本身体壁松弛，小小的交合伞更加难以辨认。传统的形态鉴定日本毛刺线虫要需要大量的虫源，鉴定者具有丰富的经验，容易漏检、错检。

随着分子生物学的发展，线虫检测鉴定技术取得了重大突破，线虫的系统分类不再仅仅依靠形态学特征等传统的方法，已探索出许多线虫种群分类鉴定的分子诊断方法，利用分子技术探索不同种群的rDNA 内转录间隔区（ITS区）和rDNA 28S D2/D3区序列特征已成为近年来线虫分子诊断的研究热点。ITS区序列是一个多用途的遗传标记，位于和核糖体基因的重复簇之间，中间被核糖体基因分开。研究ITS 区域有很多优势，尤其是在样品较少而其它方法不能正确地鉴定线虫时，分析ITS区域的序列，可以更有效地鉴定和分辨更多的农业重要线虫种或近缘种。

目前，国内外尚无基于日本毛刺线虫的的ITS区序列设计特异性引物检测日本毛刺线虫的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有日本毛刺线虫检测技术的缺陷和不足，以及因日本毛刺线虫是雪松毛刺线虫复合种中的隐种，形态难以区分的问题，提供一种可以特异性检测日本毛刺线虫，区分日本毛刺线虫和雪松毛刺线虫的引物组。

本发明的目的是提供一种检测日本毛刺线虫的引物组。

本发明另一目的是提供上述检测日本毛刺线虫的引物组的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种检测日本毛刺线虫的引物组，所述引物组包括上游引物TjF和下游引物TjR，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示（PCR扩增片断大小为400bp）。

上述检测日本毛刺线虫的引物组在检测日本毛刺线虫方面的应用，以及在鉴定区分日本毛刺线虫和雪松毛刺线虫方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。

一种特异性检测日本毛刺线虫的方法，是以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增反应，根据扩增反应的结果判断样品中是否日本毛刺线虫，判断标准是：当扩增产物出现特异性的400bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA。

其中，优选地，所述PCR的反应体系为： PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 补齐，总体积25μL。

优选地，所述PCR的反应程序为：98℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40个循环；16℃保温。

另外，进一步优选地，还需要在PCR反应体系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反应体系为：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补齐，总体积25μL；其中，引物D2A和D3B的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

此时，当扩增产物同时出现两条特异性的400bp和800bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA；如果扩增产物没有出现800bp条带，表明待测样品DNA有问题。

一种检测日本毛刺线虫的试剂盒，包含有上述的上游引物TjF和下游引物TjR。

优选地，所述试剂盒还包含有PCR扩增所需的PCR反应缓冲液和DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒的使用方法为：以待测样品的DNA为模板，利用上游引物TjF和下游引物TjR进行PCR扩增，根据扩增反应的结果判断样品中是否日本毛刺线虫，判断标准是：当扩增产物出现特异性的400bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA。

优选地，所述PCR的反应程序为：98℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40个循环；16℃保温。

优选地，所述PCR的反应体系为： PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 补齐，总体积25μL。

另外，更优选地，还需要在PCR反应体系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反应体系为：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补齐，总体积25μL；其中，引物D2A和D3B的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

此时，当扩增产物同时出现两条特异性的400bp和800bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA；如果扩增产物没有出现800bp条带，表明待测样品DNA有问题。

而应用于鉴别区分日本毛刺线虫与雪松毛刺线虫时，当扩增产物出现特异性的400bp扩增条带时为日本毛刺线虫，无400bp扩增条带时为雪松毛刺线虫。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种特异性检测鉴定日本毛刺线虫的PCR引物组，可以特异性地鉴定区分日本毛刺线虫与雪松毛刺线虫，特异性更好，不需要测序，可实现快速鉴定。

而且，该引物组的PCR扩增片段大小为400bp，灵敏度高，容易扩增，对于日本毛刺线虫的检测以及日本毛刺线虫和雪松毛刺线虫的鉴定区分方面，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为PCR特异性检测结果电泳图，其中，M为Marker 2000，泳道1-10分别为Tj-1、Tj-2、Tj3、Tj4、Tc-1、Tc-2、Tc-3、P、Pp、阴性对照。

图2为灵敏度检测结果，其中M为Marker 2000，泳道1-6分别为稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍的DNA、阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 引物设计和PCR体系构建

1、引物设计

针对设计日本毛刺线虫的检测引物，经过了大量的筛选和研究，最终得到引物组TjF/TjR，在ITS2片段的392-412位置。

上游引物TjF和下游引物TjR（ITS2区引物）的序列如下所示：

SEQ ID NO.1（上游引物TjF）：5'-ATCGATGAAGAACGCAGC-3'

SEQ ID NO.2（下游引物TjR）：5'-tacaacgttgagcgaacgaag-3'

该引物对的PCR扩增片段大小为400bp，以日本毛刺线虫DNA为模板进行PCR扩增验证，电泳片断符合预期。

2、经过大量实验的优化筛选，利用上述引物对扩增日本毛刺线虫DNA的PCR条件如下：

（1）PCR体系：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补齐，总体积25μL。

其中，引物D2A和D3B（D2D3区引物）是所有毛刺线虫的通用检测引物，序列如下：

SEQ ID NO.3（上游引物D2A）：5'-acaagtaccgtgagggaaagttg-3',

SEQ ID NO.4（下游引物D3B）：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3' 。

（2）PCR程序如下：98℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40个循环；16℃保温。

扩增结果显示4种引物均为0.5μL，PCR保存4年的DNA模板没问题，两条带都能扩增。但是PCR保存5年的DNA模板只能扩增400bp短片段，不能扩增800bp的D2D3片段，当增加D2A、D3B引物时就能扩增两条带。因此，当待测样品DNA模板保存时间在4年以内时，四条引物均使用0.5μL即可；当待测样品DNA模板保存时间大于4年时，需将引物D2A和D3B的量增加至0.75μL。

当扩增产物同时出现两条特异性的400bp和800bp条带时，表明待测样品DNA没有问题，且其中含有日本毛刺线虫DNA。如果扩增产物没有出现800bp条带，表明待测样品DNA本身有问题，需要重新提样进行检测。

实施例2 日本毛刺线虫与雪松毛刺线虫的特异性检测

1、实验材料如表1所示

表1

2、抽提DNA

在200μL Eppendorf管中加入8μL预冷的PCR Buffer。在平玻片上滴20μL ddH₂O，挑入一条线虫，用手术刀将线虫切成2至多段，然后迅速吸取含尽量多的这些线虫片段的悬浮液10μl，加入含有8μ L PCR Buffer液的Eppendorf管中，再向管中加入2μL预冷的1mg/mL蛋白酶K，使总体积为20μL。迅速将管放入-70℃冰箱至少10min，而后将Eppendorf管置于PCR仪中65℃恒温60min，以降解DNase，接着95℃恒温10min，以变性蛋白酶K，此时即可取此DNA悬浮液2μL直接做PCR或-20℃保存。

3、PCR检测体系和程序如实施例1所述。PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳，电压10V/cm，取PCR产物5μL上样。电泳30min后，在凝胶成像系统下拍照。

结果如附图1所示，只有Tj-1、Tj-2、Tj-3、Tj-4四个日本毛刺线虫样品扩增出了特异性的400bp（日本毛刺线虫ITS2特异条带）和800bp（所有毛刺线虫D2D3片段）两条带。而其他线虫样品，包括雪松毛刺线虫，均只有800bp一条扩增条带。

同时，上述结果也显示了，本发明的上游引物TjF和下游引物TjR对日本毛刺线虫的检测灵敏度可达到1条线虫的灵敏性。

实施例3 检测灵敏度

1、按照实施例2的方法，提取一条日本毛刺线虫样品的DNA，进行梯度稀释后进行检测，方法参照实施例2。

2、结果如附图2所示，泳道1-6分别为稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍的DNA、阴性对照。

结果显示，利用本发明的上游引物TjF和下游引物TjR，可以检测到稀释1000倍的DNA，即可以检测到0.001条日本毛刺线虫的DNA。

实施例4 日本毛刺线虫检测试剂盒

1、日本毛刺线虫检测试剂盒，包含有上述的上游引物TjF和下游引物TjR，以及PCR扩增所需的PCR反应缓冲液和DNA聚合酶。

更进一步优选地，所述试剂盒还包含上述引物D2A和D3B。

2、所述试剂盒的使用方法为：以待测样品的DNA为模板，利用上游引物TjF和下游引物TjR进行PCR扩增，根据扩增反应的结果判断样品中是否日本毛刺线虫，判断标准是：当扩增产物出现特异性的400bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA。

所述PCR的反应程序为：98℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40个循环；16℃保温。

所述PCR的反应体系为： PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 补齐，总体积25μL。

另外，更进一步地，还需要在PCR反应体系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反应体系为：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补齐，总体积25μL。

此时，当扩增产物同时出现两条特异性的400bp和800bp条带时，表明待测样品DNA中含有日本毛刺线虫DNA；如果扩增产物没有出现800bp条带，表明待测样品DNA有问题。

应用于鉴别区分日本毛刺线虫与雪松毛刺线虫时，当扩增产物出现特异性的400bp扩增条带时为日本毛刺线虫，无400bp扩增条带时为雪松毛刺线虫。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种检测日本毛刺线虫的引物组及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物TJF

<400> 1

atcgatgaag aacgcagc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物TJR

<400> 2

tacaacgttg agcgaacgaa g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 上游引物D2A

<400> 3

acaagtaccg tgagggaaag ttg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物D3B

<400> 4

tcggaaggaa ccagctacta 20