一组用于皮肤相关基因检测的引物组合物及检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组用于皮肤相关基因检测的引物组合物及检测方法；

背景技术：

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及单个碱基的改变，这种改变可由单个碱基的转换、颠换、碱基的插入或缺失引起。近年来研究表明，这种在DNA序列上的单个碱基的改变能够影响人类疾病的发生、抵御外来病原微生物的能力、身体对化学物质及药物的反应等，这种相关性也被应用于各领域的研究中：1)生物医学领域：在全基因组相关性分析中，SNP用来比较种群中基因组上的相应区域作为疾病相关的分子标记；2)法医鉴定领域：SNP曾在最初的法医鉴定方面做出过卓越贡献。随着DNA指纹技术的发展，SNP逐渐被STR(Short tandem repeat,短串联重复序列)所代替。然而当样品量极低，或样品有降解发生时，SNP鉴定仍然是优于STR的鉴定工具；3)药物遗传学领域：一些SNP与不同药物的代谢能力有关，如携带特定SNP的人群在服用了相应的药物，如丁胺卡那霉素、小诺霉素后出现耳聋症状。这些与药物代谢能力有关的SNP位点，可以作为治疗癌症、感染性疾病等的治疗靶标。

越来越多的研究发现，大量的SNP位点与癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、心脏病甚至机体自身的抗氧化能力等有密切的联系，如G6PC(葡萄糖－6－磷酸酶)、GCK(葡萄糖激酶)的SNP位点与机体糖尿病的发生有关；TNF-α(Tumor necrosis factor,肿瘤坏死因子)的SNP位点与机体过度免疫反应有关；SOD2(Superoxide Dismutase,超氧化物歧化酶)SNP位点与机体抗氧化能力下降有关。基因检测是通过血液、其他体液、细胞对个体的DNA进行检测的技术，通过提取其中特定的分子信息来预知身体患疾病的风险，比如乳腺癌风险基因检测、阿尔兹海默氏症风险检测、心血管疾病风险检测、糖尿病风险检测等等，当然现阶段人们接触最多的就是无创产前诊断，这种诊断方式具有安全性高、准确性好、无痛无创、避免羊水穿刺引发感染的风险。随着测序技术的不断发展、测序成本的不断降低，基因检测已进一步扩大了应用领域和应用人群，除了与疾病相关的检测外，基因检测的公司还开发出了天赋基因检测、智商基因检测、健身基因检测、肥胖基因检测等与人们生活质量相关的各种检测项目。世界各国也正积极推动着基因检测的发展，美国更是提出了精准医疗计划，相信在不久的将来，基因检测将会在我们日常生活的各个领域为人类服务。

除了上述疾病相关的基因，国外的一些护肤品公司更是提出了精准护肤的皮肤检测项目，通过提取皮肤相关基因的基因信息，针对不同的体质来制订不同的护肤方案，以此来解决皮肤出现的健康问题，并延缓肌肤的衰老。而在我国，此类检测还处于缺失状态，大部分人的护肤还处于不断地“试验”阶段，对自己的皮肤不够了解，不能够很好地根据自身机体状态选择护肤品，往往造成更严重的皮肤问题的出现。一些美容机构使用皮肤检测仪来确定肤质，这种检测仪只能观察到皮肤表面存在的问题，而不能对机体的体质有一个深入的了解，所以采取的方法往往治标不治本，不能够解决根本问题。因而，目前的皮肤检测方法仍有待改进。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一组用于皮肤相关基因检测的引物组合物，用于对相应皮肤相关基因的特定区域进行扩增并测序，能够同时对23个皮肤相关基因的SNP位点进行检测，具有敏感度高、方便全面、快速的优点。

本发明的另一目的在于提供利用本发明所述的引物组合物检测皮肤相关基因的SNP位点的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一组用于皮肤相关基因检测的引物组合物，该引物组合物包括第一引物组和第二引物组；所述第一引物组包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.46所示的23对引物序列；所述第二引物组包括如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的引物。

一种利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法，该方法包括以下步骤：

1)待测样本提取：从生物样本中提取包含皮肤相关基因SNP位点的基因组获得待测样本DNA；

2)构建皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库：利用第一引物组对皮肤相关基因SNP位点，以待测样本DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，获得第一轮扩增产物；利用第二引物组，以第一轮扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增，获得第二轮扩增产物，用第二轮扩增产物构成所述待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库；

3)测序：对上述待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库进行测序，基于测序结果确定待测样本DNA的核酸序列。

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，步骤2)中，按照20μL总体反应体系计算，第一轮PCR扩增的反应体系如下：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述第一轮PCR扩增的反应程序为：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，步骤2)中，按照20μL总体反应体系计算，第二轮PCR扩增的反应体系如下：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述第二轮PCR扩增的反应程序为：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述生物样本为人体唾液或口腔拭子样本。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

1.本发明所述的引物组合物能够特异性识别皮肤相关基因的SNP位点，并能够同时对23个皮肤相关基因的SNP位点进行检测；同时该引物组具有高度特异性，能够对选取的23个皮肤相关基因的SNP位点区域进行特异性扩增，无非特异性产物的产生；

2.本发明所述的引物组合物用于皮肤相关基因检测，降低了实验成本、简化了实验步骤并具有良好的可重复性，具有敏感度高、方便全面、快速的优点；

3.本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法采用本发明所述的引物组，一步即能够实现23个皮肤相关基因的SNP位点核酸序列的富集及文库的构建，操作简单、耗时少、鉴定结果准确、可重复性高；

4.本发明的引物通过与不同测序平台adapter连接能够实现在不同的高通量测序平台之间的转换，满足不同测序平台的测序要求。

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是对23对引物结合特异性电泳检测结果；其中(a)为1-19对引物的电泳结果，(b)为20-23对引物的电泳结果；

图2是样本PCR扩增结果，其中(a)为1号样本的结果，M为标准带；(b)为2号和3号样本与阴性对照的结果(N)，N是模板为去离子水的阴性对照，M为标准带；(c)为4号、5号样本的结果，M为标准带。

具体实施方式

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能用于指示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，既定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明所述的一组用于皮肤相关基因检测的引物组合物，该引物组合物包括第一引物组和第二引物组；所述第一引物组包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.46所示的23对引物序列；所述第二引物组包括如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的引物。

本发明的引物组合物能够特异性地识别皮肤相关基因的SNP位点，并能够同时对23个皮肤相关基因的SNP位点进行检测。进而，利用本发明的引物组合物对皮肤相关基因的23个SNP位点进行两轮PCR扩增，并通过摸索引物的浓度比例及扩增条件，一步即能够实现23个皮肤相关基因的SNP位点核酸序列的富集；同时该引物组合物具有高度特异性，能够对选取的23个皮肤相关基因的SNP位点区域进行特异性扩增，无非特异性产物的产生。该引物组合物降低了实验成本、简化了实验步骤并具有良好的可重复性。进而测序后，能够有效获得23个皮肤相关基因的SNP位点核酸序列信息，经过比对分析即可获得相应的基因信息。

一种利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法，该方法包括以下步骤：

1)待测样本提取：从生物样本中提取包含皮肤相关基因SNP位点的基因组获得待测样本DNA；

2)构建皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库：利用第一引物组对皮肤相关基因SNP位点，以待测样本DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，获得第一轮扩增产物；利用第二引物组，以第一轮扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增，获得第二轮扩增产物，用第二轮扩增产物构成所述待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库；

3)测序：对上述待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库进行测序，基于测序结果确定待测样本DNA的核酸序列。

上述方法中，利用本发明构建待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库，一步即能够实现对23个待测皮肤相关基因SNP位点核酸序列的富集及文库的构建。进而，将利用本发明的方法获得的待测皮肤相关基因SNP位点测序文库，用于测序和比对分析后，即可确定相应核酸序列，以及SNP位点基因信息，实现对皮肤相关基因的23个SNP位点检测的目的。因而，本发明的方法适用于各种皮肤相关基因SNP位点的检测，一次反应即可获得相应基因的基因信息，成本低、效率高、敏感度高、鉴定结果准确、可重复性好。

上述方法中，由于多个待测样本的标签序列各不相同，根据待测样本的选择，可以分别独立地构建多个待测样本的皮肤相关基因SNP位点测序文库，针对多个待测样本中的每一个待测样本，分别独立地构建待测皮肤相关基因SNP位点核酸测序文库。此外，也可以将多个待测样本的SNP位点核酸测序文库混合以获得混合文库。

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，步骤2)中，按照20μL总体反应体系计算，第一轮PCR扩增的反应体系如下：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述第一轮PCR扩增的反应程序为：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，步骤2)中，按照20μL总体反应体系计算，第二轮PCR扩增的反应体系如下：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述第二轮PCR扩增的反应程序为：

本发明所述的利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测的方法中，作为进一步的方案，所述生物样本为人体唾液或口腔拭子样本。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，所采用的试剂、原料及设备均可以通过商业渠道获得。

实施例1

利用本发明所述用于皮肤相关基因检测的引物组合物对皮肤相关基因进行检测，具体方法如下：

1)取样：取健康人口腔唾液，在取样前30分钟，未进食或饮水，取样时以舌尖刮擦上颚刺激唾液腺分泌唾液，并将唾液与唾液保存液1:1比例混匀；

2)待测样本DNA提取：取上述混合物2000g离心5分钟，弃上清，180μl PBS重悬，并将重悬后的样品转移至新的2.0ml离心管中，加入25μl蛋白酶K溶液、200μl裂解缓冲液，震荡混匀30秒，60℃水浴15分钟；加入200μl无水乙醇，震荡混匀；样品转移至DNA结合柱，最大转速离心1分钟，弃废液，加入500μl DNA结合缓冲液，最大转速离心1分钟；弃废液，加入700μl洗涤缓冲液，最大转速离心1分钟；加入70℃预热的洗脱缓冲液70μl，室温静置3分钟，最大转速离心1分钟，离心后液体作为PCR模板；

3)皮肤相关基因SNP位点的PCR扩增：基于23个皮肤相关基因的SNP位点设计能够对其进行特异性扩增的引物，包括第一引物组SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.46，其中第一引物组包含SNP位点序列特异性引物序列及一段通用引物序列；第一引物组的引物能够分别同时与各自皮肤相关基因SNP位点序列特异性结合，以上述PCR模板进行第一轮PCR扩增，是扩增的内引物；然后设计第二轮PCR扩增引物组SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48，该引物包含与第一引物组相同的通用引物序列和adapter序列，该引物能够结合在第一轮PCR产物上，通过通用引物将adapter序列连接到第一轮PCR扩增产物上，是PCR的外引物；

第一引物组的23对序列如下：

第1对引物：F:TAATACGACTCACTATAGGGGGTTCCAGACCATTGACATCGAGC

R:ACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACCTCCCTCGTAGGTTTAGAGGA

第2对引物：F:TAATACGACTCACTATAGGGGGGAAAACTGCCTGTGCCACGT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACATGGCGCAATTGTCCAAGAAG

第3对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGTTACAGGTATAAGCCACCGCAC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAGTGGTTGGAGTGATGACGAACA

第4对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGACTGACCGGGCTGTGCTTTCTCGTC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACATGATCTGCGCGTTGATGTG

第5对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGTGAACTCACATGTTATGCCACTTAG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAACTTTCCTCCCCTTATGGATTCC

第6对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGACACAGGCCGGACAGAAGCT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATAGACACGGACTCGGTAGTTGGA

第7对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAAGCTTTTTCATTTTACTGAAGC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAGGTATCACTTGGCAACCAGTCT

第8对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGGGCCCTGCATCTAACCACTAAA

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATGGACTGAATGAGACCCTCAGA

第9对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGGCAGCTCTAATGACAGGATGGT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAGCATTTCCTGCTCCAGCCAG

第10对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGAGCTAGGCCATATGATGAAGAT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATGAGTGCCATTTCATTCACACT

第11对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGGCATTCTCCTATCTGCCTCTGC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACTGCTTCCCAAGTTCTGGTGTAGTG

第12对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCAGGCAGTTACTGGTTCTGGAT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAGGAGGATTTGCTTGCTGAACAC

第13对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCACCAGCCAAAGAATGTGGTTG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATGCTCACATCATGCTCGTGGA

第14对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGACCCACCTCACAGGAAGAAAAC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACCTTCTCTTCTTGTCCTGGCTC

第15对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCTTGATACCCAGACACCCCTTG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAACCTTGTGAACCAGCTTTGCTA

第16对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGAGAGATGGTACCTGACATCTGG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATCAGTAACTCTATAGACACTGTCTAGC

第17对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGCTTTTCATCACTGGGAAG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGATGAACAATTACATGCCAATAAACTG

第18对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCAGACCTGGTCCCCAAAAGAAA

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAACACAAGCATCAAGGATACCCC

第19对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCAACCAGATCATGCAAAGCAGG

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACTAGAGCTAGAAACGGGCCATG

第20对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGAGAGAAAGGGTGGTCTGAT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACCCCAGTGAGTTGTGTGTGTAA

第21对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCCCGACCAGGAGATGAAAACAT

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACTTTTCTTTGCGGCATACCCTG

第22对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGAGCAAGATCCTGTCTCTACCTGA

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGAAGTCATCAGAGTATCCAGGGTT

第23对引物F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCATGGAGCTGCAGGTGATCAC

R:TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGACCCATGTACTGCTTCATCTGCT

第二引物组序列如下：

A1:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACTAATACGACTCACTATAGGGGG

P1:CCTCTCTATGGGCAGTCGGTCATTACGCCAAGCTATTTAGGTGAGA

下表1为各引物对的各项指标：

同时在NCBI数据库中验证上述引物的特异性，结果显示，上述引物都能够特异性地扩增相应基因的SNP位点；采用二代高通量测序平台测序，可在第二轮PCR引物SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48的5’端添加标签序列(tag序列为6-8个随机碱基)，然后通过将不同样本的产物混合后再进行测序，并通过标签序列对测序结果进行区分，由此能够在满足检测要求的同时节约成本；同时为了满足不同测序平台的要求，可将第二引物组的adapter序列替换为相应测序平台的adapter序列，便于使用不同的测序平台进行测序；

其中PCR扩增具体如下：将所需试剂放于冰上融化，充分混匀后，按下表配制反应体系，分装至PCR管，混匀并短暂离心；在20μl反应体系中，第一轮模板为被检测样本提取的基因组DNA溶液，上下游引物为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.46，其中各引物混合成引物混合物溶液(上、下游引物分别混合成上游引物混合物溶液和下游引物混合物溶液)，上、下游引物混合物溶液各1.2μL(浓度10μM)，反应程序退火温度为55℃，25个循环，以获得第一轮扩增产物；第二轮PCR扩增，在20μl反应体系中，取上述第一轮反应产物2μl作为反应模板，上下游引物分别为0.4μl(浓度10μM)的SEQ ID NO.A1和SEQ ID NO.P1，反应程序退火温度为58℃，15个循环，以便获得第二轮扩增产物；反应管置于PCR仪按以下表的程序进行反应；

按照上述步骤1)-步骤3)另外处理4个样本，得到5个样本的第二轮扩增产物，分别标明1-5号；

4)电泳检测：取3μl 5个样本的第二轮扩增产物进行凝胶电泳检测，采用1％(m/v)浓度琼脂糖凝胶，150V恒定电压电泳15分钟，染色后在紫外灯下检查扩增效果；图2为PCR扩增结果，其中(a)为1号样本的结果，M为标准带；(b)为2号和3号样本与阴性对照的结果(N)，N是模板为去离子水的阴性对照，M为标准带；(c)为4号、5号样本的结果，M为标准带。图2中可看到电泳条带单一，大小约250bp左右，与理论值大致相符，没有其他非特异条带存在。由于各样本的浓度存在差异，产物条带亮度不一；第一引物组中23对引物的电泳图参见图1。

5)纯化：对第二轮扩增产物进行纯化，纯化方式选用Ampure Beads，去除反应液中残留的引物、dNTPs、盐分、非特异PCR产物，最终满足产物长度在200-500bp，DNA纯度：OD260/OD280＝1.6-2.0；

6)测序：采用Ion torrent二代测序平台测序，将1-5号样本的第二轮扩增产物混合后进行测序，通过5’端添加的标签序列对测序结果进行区分，由此能够在满足检测要求的同时节约成本；

7)信息分析：将测序结果利用BWA序列分析软件将待测皮肤相关基因SNP位点与参考序列进行比对，所述参考序列包括各种待测皮肤相关基因SNP位点的核酸序列，其中参考序列来源于NCBI人类基因组参考序列，以此获得23个皮肤相关基因SNP位点的核酸序列：SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.71，以此确定了样本相应的基因信息。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。