可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218、基因片段及重组蛋白的制作方法

本发明属于生物领域，尤其是一种对嘌呤核苷分解速率快、分解率高的可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218、基因片段及重组蛋白。

背景技术：

血尿酸不仅仅是作为判定痛风病的指标，同时也是血压、血糖和血脂严重病患的一个重要判定指标，血尿酸超标与脂代谢紊乱、糖尿病、高血压、肥胖等多种代谢性疾病密切相关。现有高尿酸血症除以药物治疗之外，一般都要辅以严格的饮食控制，即尽可能减少外源性嘌呤类物质摄入。然而，由于各种食物中嘌呤类物质含量并没有准确的定论，特别是改善食物风味的鸡精、蚝油、鱼露等鲜味剂，其主要成份5’-呈味核苷酸二钠（包括5’-鸟苷酸二钠和5’-肌苷酸二钠）均为嘌呤类物质，因此严格的饮食控制是极其困难的。

肠道乳酸菌是机体胃肠道内的有益菌群，虽然已经证实其具有对嘌呤、嘌呤代谢中间产物肌苷、鸟苷以及尿酸的吸收功能，但现有菌株对嘌呤核苷的分解速率及分解率均较低，不能够满足降低血尿酸的临床要求。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种对嘌呤核苷分解速率快、分解率高的可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218、基因片段及重组蛋白。

本发明的技术解决方案是：

一种可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218（Lactobacillus brevis），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 12797。

可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218的 DNA序列如SEQ ID NO：1 所示。

一种上述可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218的基因片断，其 DNA序列如SEQ ID NO：2 所示。

一种上述可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218的基因片断的重组蛋白，是以短乳杆菌DM9218的DNA为模板进行PCR反应，将所得PCR产物利用基因克隆方法所得到的重组蛋白，所述PCR反应上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

本发明的短乳杆菌DM9218（Lactobacillus brevis）可快速分解肌苷、鸟苷等嘌呤核苷，其分解速率及分解率均高于现有技术，属于国家允许应用于保健食品范畴内的益生菌，可应用于制备降低高尿酸药物，安全、无毒副作用。

附图说明

图1是本发明实施例基因片段与载体连接双酶切后的电泳图。

图2是本发明实施例经诱导表达后菌液的SDS-PAGE电泳图。

图3是本发明实施例表达的重组蛋白SDS-PAGE电泳图。

图4是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例转入空载体的大肠杆菌BL21菌体与肌苷、鸟苷反应液的色谱图。

图6是本发明实施例未诱导的重组菌株与肌苷、鸟苷反应液的色谱图。

图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白与肌苷、鸟苷反应液的色谱图。

图8是本发明实施例纯化后的目标蛋白与其它物质对肌苷与鸟苷的分解率对比图。

短乳杆菌DM9218保藏日期：2016年7月20日；

分类命名：短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No. 12797。

具体实施方式

实施例1：

以乳酸菌选择培养基对盐渍白菜（酸菜）发酵液进行培养，之后再37℃厌氧培养，按照常规方法分离得到短乳杆菌DM9218，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 12797。

实验：

1．验证短乳杆菌DM9218分解嘌呤核苷的能力

将短乳杆菌DM9218接种于MRS培养基厌氧培养48h，离心收集菌体，向菌体中添加含有肌苷、鸟苷的中性磷酸盐缓冲液。在厌氧条件下37℃，120r/min振荡培养60min，随后离心取上清液按9：1比例加入 0.1mol/l HClO₄溶液，用于RP-HPLC分析。色谱条件：高效液相色谱仪：LC-20A；反相液相色谱柱：Cosmosil-5C₁₈-AR-；流动相：0.1μmol/l NaClO₄–0.187mol/l H₃PO₄；流速：1ml/min；柱温：40℃；保留时间：40min；测定波长：254nm。

基于HPLC色谱图与标准曲线，计算上清液中残余核苷量及分解速率，结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，短乳杆菌DM9218分解嘌呤核苷速率快，分解率高。

2．验证短乳杆菌DM9218胆盐耐受能力

DM9218菌株以20%的接种量接种至含0.1%胆盐MRS培养基中，培养24h后传代，传代两次后以5%接种量接至正常液体MRS培养基，培养24 h；再以20%接种量接种至含胆盐0.2%MRS培养基中，重复上述操作进行驯化；随后以20%接种量接种至含胆盐0.3%MRS培养基中，传代两次后取适量培养液涂布在MRS固体培养基上，37℃培养48h。挑取长出的单菌落，接种至正常液体MRS培养基。

采用同样的HPLC方法对驯化后获得的菌株进行嘌呤核苷分解能力测定，DM9218菌株驯化前后分解嘌呤核苷能力测定结果如表2。

表2

结果表明核苷分解能力并没有因驯化而减弱。

3．短乳杆菌DM9218菌株分解核苷能力分析实验

采用同样的HPLC方法分析短乳杆菌DM9218菌株培养乏液和细胞内容物对肌苷和鸟苷的分解能力，结果是该菌株的培养乏液对肌苷和鸟苷的分解率分别为16%和11.6%，而菌株细胞内容物对肌苷和鸟苷的分解率分别为83.1%和84.5%，由此证明该菌株降解核苷能力主要是由短乳杆菌DM9218菌株胞内产生的水解酶来发挥作用。

4．动物实验验证短乳杆菌DM9218菌株降血尿酸的功效

32只6周龄雄性Wistar大鼠，适应性饲养3d后，随机分成高尿酸血症模型组、短乳杆菌DM9218菌干预组、别嘌呤醇干预组、正常对照组4组。前三组饲喂高嘌呤鼠粮，正常对照组给予普通鼠粮，各组均自由饮水，饲喂7d后开始实验。

1~7天：前三组每天按350mg/100g体重腹腔注射Oxonic acid potassium salt CMC-Na混悬液，同时辅以高嘌呤鼠粮，自由饮水；

8~14天：短乳杆菌DM9218菌干预组：MRS厌氧培养短乳杆菌DM9218菌，离心分离菌体，以生理盐水调整至4号麦氏浊度（1.2×10⁹cfu/ml），每只大鼠灌胃1.0ml 菌悬液，持续7d；别嘌呤醇干预组：每天每只大鼠4.2mg/100g灌胃别嘌呤醇CMC-Na混悬液，持续7d；高尿酸血症模型组：灌胃1.0ml CMC-Na溶液，持续7d。

分别在动物实验开始的第0d、第14d，收集血液，3000r/min离心分离血浆，测定血尿酸（UA）含量，四组大鼠血尿酸含量（Mean±SD，n=8）见表3。

表3

注：*表示与模型组相比具有显著性差异，P＜0.05；#表示与别嘌呤醇组相比具有显著性差异，P＜0.05

通过表3可以看出短乳杆菌DM9218具有明显的降低高尿酸血症模型大鼠血尿酸水平的效果。

实施例2：

短乳杆菌DM9218 菌株的全基因组测序。

将活化好的短乳杆菌DM9218，经过培养、离心收集菌体、洗涤菌体、溶菌酶破壁、分离、纯化等步骤获得细菌基因组DNA。委托上海派森诺生物科技有限公司对DM9218 全基因组测定，DNA序列如SEQ ID NO：1 所示。

实施例3：

通过对短乳杆菌DM9218全基因组序列分析，基因A0008编码肌苷水解酶，可参与分解肌苷，基因A0008的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4：

可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218的基因片断的重组蛋白，依次按照如下步骤制备：

a. 采用DNA提取试剂盒快速提取短乳杆菌DM9218的基因组DNA，然后以短乳杆菌DM9218基因组DNA为模板，利用为PCR扩增可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218的基因片断而设计的引物（SEQ ID NO：3 、SEQ ID NO：4所示的引物）进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物与载体pET28a分别用限制性内切酶Xho I和Nco I酶切，酶切产物纯化后进行连接，构建表达载体。将表达载体转化至E.coli BL21宿主菌中，然后涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落，接种于50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm/min过夜培养。提取质粒，用Xho I和Nco I双酶切电泳鉴定。结果如图1所示，表明目的基因已成功同载体pET28a连接并转入宿主菌E.coli BL21中。

b. 将重组质粒转入大肠杆菌BL21后，在37℃条件下培养，至OD为0.6~0.8时，用IPTG（终浓度为0.1mM）诱导表达，收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳分析，电泳图谱如图2所示。

从图2可以看出，经IPTG诱导后，含有重组质粒的大肠杆菌有分子量大约为35kD的蛋白条带，进一步证明A0008基因重组表达载体构建成功。

c. 取诱导完成后的菌液，离心收集菌体沉淀，加入PBS重悬菌体，超声破碎菌后4℃离心；分别对其上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，电泳图谱如图3所示。

从图3可以看出，表达的重组蛋白多数以包涵体的形式存在，但上清中也有可溶性融合蛋白的表达。

d. 上清经Ni柱亲和层析纯化蛋白。

在Ni柱亲和层析的过程中采用10-100mM的咪唑梯度洗脱，收集过柱后样品，以备SDS-PAGE电泳分析。电泳图谱如图4所示，得到清晰的蛋白条带，即A0008基因重组蛋白。

实验：

一．A0008基因重组蛋白的体外酶活检测：根据杨殿斌等已发表的方法，取表达纯化后的的蛋白进行体外酶活的分析。基于RP-HPLC方法，通过检测含肌苷、鸟苷的反应液与诱导纯化后的重组蛋白培养60min后，反应液中肌苷与鸟苷含量变化，检测诱导后蛋白降解嘌呤核苷的能力，以转入空载体的大肠杆菌BL21菌体和未诱导的重组菌株作为对照，结果分别如图5、图6、图7所示，结果表明转入空载体的大肠杆菌BL21菌体和未诱导的重组菌株没有降解核苷的能力，而经IPTG诱导纯化后的重组蛋白有较高降解肌苷的能力。

二．同样基于RP-HPLC方法，检测含肌苷、鸟苷的反应液与MRS培养液、短乳杆菌DM9218菌体、未诱导重组蛋白上清与培养60min后，反应液中肌苷与鸟苷含量变化，各物质对肌苷与鸟苷的分解率与图8所示。表明短乳杆菌DM9218菌体与诱导纯化后的重组蛋白具有较强的嘌呤核苷分解率。

序列表

<110> 大连医科大学

<120> 可降低血尿酸的短乳杆菌DM9218、基因片段及重组蛋白

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211>

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis

<400> 1

CACTTGTCACCGGCCCATGACTAACTTAGCTGCTTTGAAGAAGGCCCCAGAAATTGCCACAGAAATGGGCAACATGACCTTCATGGGTGGCGCCTTAACCAGGTAACGTAACCCGTTTCGCTGAAGCAAACATTAACCAAGATGCCGAAGCCGCTAACGCCGTCCTCACTAGCCCACTCCACTCAACGATGGTTGGCCTAGATGTTACGCTACGGACTTTGTTGACTAAGAAAGAAACCCAACAAGCCTACAAGCAATTTAACGACAACTTGGGTGGCTGTGCACTGCACGACCCATTAGCCGTTGGGGTAGCGTTAGACCCTAGCTTTGTGACAACGATTGATCTCAATATGGTCAACACCAATAAGGAAACTTATGGCCGAACTATCGGTGATGACAACCGTTTGAACGACCCAACAA

<210> 2

<211>

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevisA0008基因

<400> 2

MILDLDTGIDDSLAIAYALGAPDVDLIGIIGSYGNVVIEEGGKNALKILELLGHTDIPVYLGESHSSTSDHFDRMEVSANIHGQNGIGEVDLPEPTRAIESEGVDFLIDAVHQYGKDLTLVPTGPMTNLAAALKKAPEIATEMGNMTFMGGALTMPGNVTRFAEANINQDAEAANAVLTSPLHSTMVGLDVTRTLLTKKETQQWRDLGTTSGEKFADIVDYYIEAYKQFNDNLGGCALHDPLAVGVALDPSFVTTIDLNMVVNTNKETYGRTIGDDNRLNDPTNVKVAMVDKDRYLKVFMDYLTNLFKEN

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CCATGGCAAAACGCAAAATG 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CTCGAGGTTTTCTTTGAATA 20