本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种清沥草多糖及其制备方法与应用。
背景技术：
清沥草为芸香科植物，多分布于我国广西及越南国境内，性味苦寒，有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效，全株入药。据《广西地方药材志》记载，清沥草具有“清热燥湿，泻火解毒，除骨蒸清虚热”，用于湿热泻痢，黄疸，带下，热淋，湿疹瘙痒。民间利用清沥草水煎剂治疗小儿皮肤湿疹，有较好的疗效。然而，迄今为止，对清沥草的药理研究仍较少，仅限于民间偏方使用，对其活性成分的研究与应用仅处于初始阶段。
多糖是一种广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是一种重要的生物体能量资源和构成材料，同时还参与细胞的多种活动。研究表明，许多植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗辐射和延缓衰老等生物活性。但对于清沥草中的多糖的功效，尚未有相关研究。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种清沥草多糖及其制备方法与应用，提供的制备方法具有多糖提取率高、提取得到的多糖稳定性高等特点，制备得到的清沥草多糖对脚癣主要致病菌有显著的抑制作用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过筛，收集细粉；s2：将细粉采用提取液进行提取，然后过滤，收集滤液；s3：将滤液浓缩，得到浓缩液，然后加入乙醇水溶液，混合均匀，0～5℃静置后离心，收集固体；s4：将固体采用无水乙醇和/或石油醚洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；s5：将粗多糖溶解于水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，再用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。需要说明的是，s6中，减压浓缩至干，得到的类白色粉末，即为清沥草多糖。
在本发明的进一步实施方式中，s2中，提取液是质量分数为2％～5％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的10～30倍；提取的温度为50～80℃，提取的时间为2～5h。
在本发明的进一步实施方式中，s3中，浓缩为减压浓缩，浓缩液的液固比为(1.5～2.5):1，乙醇水溶液的体积分数为85％，乙醇水溶液的质量为浓缩液的质量的10～20倍，静置的时间为5h。
在本发明的进一步实施方式中，s5中，粗多糖和水的质量比为1:5，上柱速率为1.0～3.0bv·h-1，洗脱速率为2.0～3.0bv·h-1，乙醇水溶液的体积为2.0～10.0bv，乙醇水溶液的体积分数为50％。需要说明的是，bv是指大孔树脂的体积。
在本发明的进一步实施方式中，s1中，细粉的粒径小于或等于0.250mm。
第二方面，本发明保护根据上述制备方法制备得到的清沥草多糖。
第三方面，本发明还保护上述清沥草多糖在制备预防和/或治疗脚癣药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种包括上述清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：清沥草多糖1.0％～10.0％、16～18醇3.0％～6.0％、白油8.0％～10.0％、硬脂酸单甘油酯2.0％～3.0％、氮酮1.0％～2.5％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为水。
第五方面，本发明提供了包括上述清沥草多糖的软膏剂的制备方法，包括如下步骤：s101：将16-18醇、白油、硬脂酸单甘油酯、氮酮、棕榈酸异辛酯和氢化羊毛脂混合均匀，升温至60℃，得到第一组合物；s102：将清沥草多糖用水溶解，然后升温至60℃，得到第二组合物；s103：将第一组合物加入第二组合物中，边加边搅拌，加完后维持搅拌预设时间，得到第三组合物；s104：将第三组合物冷却，然后加入尼泊金复合酯，混合均匀，得到组合物。需要说明的是，本发明制备得到的包括清沥草多糖的软膏剂具有预防和/或治疗脚癣的作用。
在本发明的进一步实施方式中，s103中，维持搅拌的时间为5～8min；s104中，将第三组合物冷却至40℃以下。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的清沥草多糖的制备方法，不仅步骤简单、操作方便，且具有多糖提取效率高、提取的多糖稳定性高等特点；(2)本发明制备得到的清沥草多糖对脚癣主要致病菌有显著的抑制作用，可用于制备预防和/或治疗脚癣药物；(3)清沥草多糖作为天然植物活性成分的原料，以其为辅助原料，配合乳化剂、保湿剂、渗透剂、防腐剂等现有技术中常用原料制成软膏剂，且清沥草多糖在软膏剂中的重量百分比以1％～10％为宜，制备得到的软膏剂具有预防和/或治疗脚癣的功效，安全无毒副作用；(4)本发明提供的技术方案有利于提升清沥草的开发价值，具有良好的经济和社会效益。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的清沥草多糖含量-时间变化曲线曲线图。
附图标记：
1-实施例一制备得到的清沥草多糖；2-实施例二制备得到的清沥草多糖；3-实施例三制备得到的清沥草多糖；4-实施例四制备得到的清沥草多糖；5-实施例五制备得到的清沥草多糖；6-实施例六制备得到的清沥草多糖。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例一
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于50℃提取2h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为2％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的10倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液10倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，0℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为1.0bv·h-1，再用2.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为2.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为81.5％，提取率为8.5％(以葡萄糖为对照品)。
实施例二
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于80℃水浴提取4h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为2％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的2倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液10倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，0℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为2.0bv·h-1，再用10.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为2.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为85.5％，提取率为7.9％(以葡萄糖为对照品)。
实施例三
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于50℃水浴提取5h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为4％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的30倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液20倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，2℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为3.0bv·h-1，再用7.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为2.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为86.3％，提取率为7.6％(以葡萄糖为对照品)。
实施例四
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于70℃水浴提取2h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为4％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的10倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液10倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，5℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为1.0bv·h-1，再用2.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为2.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为84.9％，提取率为8.7％(以葡萄糖为对照品)。
实施例五
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于80℃水浴提取4h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为5％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的20倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液10倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，0℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为1.0～3.0bv·h-1，再用4.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为2.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为88.1％，提取率为8.1％(以葡萄糖为对照品)。
实施例六
本实施例提供一种清沥草多糖的制备方法，包括如下步骤：
s1：将阴干的清沥草粉碎，然后过60目筛，收集粒径小于或等于0.250mm的细粉；
s2：采用提取液，将细粉于80℃水浴提取5h，然后过滤，收集滤液；其中，提取液是质量分数为5％的纤维素酶水溶液，提取液的质量是细粉的质量的30倍；
s3：将滤液减压浓缩，得到液固比为2:1的浓缩液，然后加入浓缩液20倍质量的体积分数为85％的乙醇水溶液，混合均匀，0℃静置5h后离心，收集固体；
s4：将固体采用无水乙醇洗涤，然后减压干燥，得到粗多糖；
s5：将粗多糖溶解于5倍质量的水中，然后上样于d-101型大孔树脂柱，上柱速率为3.0bv·h-1，再用5.0bv的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为3.0bv·h-1，收集洗脱液；
s6：将洗脱液减压浓缩至干，得到清沥草多糖。
以测定多糖含量常规技术：蒽酮-硫酸法测得提取物中，清沥草多糖质量分数为89.7％，提取率为7.2％(以葡萄糖为对照品)。
实施例七
本实施例提供一种包括实施例六制备得到的清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：
清沥草多糖1.0％、16～18醇6.0％、白油10.0％、硬脂酸单甘油酯2.0％、氮酮1.0％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为去离子水。
制备方法包括如下步骤：
s101：将16-18醇、白油、硬脂酸单甘油酯、氮酮、棕榈酸异辛酯和氢化羊毛脂混合均匀，升温至60℃，得到第一组合物；
s102：将清沥草多糖用水溶解，然后升温至60℃，得到第二组合物；
s103：将所述第一组合物加入第二组合物中，边加边搅拌，加完后维持搅拌5min，得到第三组合物；
s104：将所述第三组合物冷却至40℃以下，然后加入尼泊金复合酯，混合均匀，得到所述组合物。
实施例八
本实施例提供一种包括实施例六制备得到的清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：
清沥草多糖2.0％、16～18醇5.0％、白油8.0％、硬脂酸单甘油酯3.0％、氮酮1.5％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为去离子水。
制备方法同实施例七。
实施例九
本实施例提供一种包括实施例六制备得到的清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：
清沥草多糖5.0％、16～18醇4.0％、白油8.0％、硬脂酸单甘油酯2.0％、氮酮2.0％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为去离子水。
制备方法同实施例七。
实施例十
本实施例提供一种包括实施例六制备得到的清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：
清沥草多糖10.0％、16～18醇3.0％、白油10.0％、硬脂酸单甘油酯3.0％、氮酮2.5％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为去离子水。
制备方法同实施例七。
实施例十一
本实施例提供一种包括实施例六制备得到的清沥草多糖的软膏剂，原料组分按重量百分比计，包括：
清沥草多糖5.0％、16～18醇4.0％、白油8.0％、硬脂酸单甘油酯2.0％、氮酮2.0％、棕榈酸异辛酯2.0％、氢化羊毛脂1.0％、尼泊金复合酯0.2％，余量为去离子水。
制备方法同实施例七。
将本发明实施例一至实施例六制备得到的清沥草多糖，在温度40±2℃、相对湿度75％±5％的条件下，放置6个月，每隔1个月取样检测多糖含量一次，多糖含量变化如图1所示。从图中可以看出，经高温稳定性考察，多糖含量下降均在5％以内，属于可控范围，说明制备的多糖稳定性良好，制备方法可行。
将本发明实施例一至实施例六制备得到的清沥草多糖、实施例七至实施例十一制备得到的包括清沥草多糖的软膏剂进行抑菌实验。
实验方法：选择引起脚癣常见致病菌t.rubrum(红色毛癣菌)、t.mentagrophytes(须毛癣菌)和e.floccosum(絮状表皮癣菌)，通过对倍稀释法测定抑制的最低浓度(mic值)。
实验结果：测定得到的结果如下表1所示。从表中可以看出，制备的清沥草多糖及包括清沥草多糖的软膏剂对引起脚癣常见致病菌红色毛癣菌、须毛癣菌和絮状表皮癣菌均有显著的抑制作用，可用于脚癣的治疗。
表1对典型致病菌的最低抑制浓度(mg.ml-1)
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。