本发明涉及医药、保健
技术领域：
，具体而言，涉及一种复配多糖及其制备方法、应用。
背景技术：
：脾虚泄泻相当于现代医学的慢性腹泻的范畴，小肠吸收不良综合征、慢性非特异性溃疡性结肠炎、肠易激综合征等，如果出现泄泻的症状同时，并有脾虚的症状，都可以按照中医脾虚泄泻来辨证论治。根据中医学有关脾胃生理及病理的论述，提示了脾胃与免疫相关，“脾”的防卫功能与现代医学免疫功能有许多相似之处，脾与免疫功能之间的关系非常密切。“脾为之卫”有两重含义：一是指全身免疫状态；另一指胃肠的屏障功能。在近代的研究中，通过临床和动物实验研究发现，脾虚证患者和脾虚证模型动物均可以见到纳呆，消瘦，体重减轻，倦怠乏力，贫血，便溏或便结等症状，同时还同样存在不同程度的非特异性免疫能力下降，红细胞免疫功能低下，体液免疫功能紊乱，消化道局部免疫功能下降等异常。对脾虚证病人和动物实验研究表明，脾虚证是以消化吸收功能低下为主的多器官和多系统功能减弱的综合病理变化。综上，脾胃能够影响人体免疫力，通过调理脾胃，就能够促进人体免疫力的增强。现有技术中也有很多药物可以用于调理人体脾胃，可是效果却较差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种复配多糖的制备方法，此制备方法操作简单，制备方便，能够制得调理效果较好的复配多糖。本发明的另一目的在于提供一种复配多糖，是一种新的多糖，用于调理人体脾胃，效果较好。本发明的另一目的在于提供复配多糖的应用。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种复配多糖的制备方法，包括以下步骤：将白术、茯苓用水煎煮2～3次，每次1～2h，然后把得到的所有煎煮液混合，得到浸提液；其中，白术和茯苓的质量比为0.8～1.2:0.8～1.2，每次煎煮所用的水的质量为白术、茯苓的总质量的8～11倍；浓缩浸提液，然后对浸提液进行分离，得到沉淀，再将沉淀进行干燥。优选地，在本发明较佳实施例中，上述浓缩浸提液是将浸提液的质量浓缩至白术、茯苓的总质量的0.8～1.2倍。优选地，在本发明较佳实施例中，上述分离浸提液包括：将体积浓度为92～98％的乙醇与浸提液混合，使浸提液中乙醇的体积浓度为65～75％，然后静置，直至浸提液中不再析出沉淀。优选地，在本发明较佳实施例中，在得到沉淀之后，还包括：将沉淀置于3800～4200r/min的转速下，离心处理8～12min。优选地，在本发明较佳实施例中，在干燥沉淀之后，还包括纯化步骤：将干燥后的粗品溶于溶解水中，然后加入Sevage溶液，超声震荡8～12min，再进行二次分离干燥；干燥后的粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比为1g：8～12ml：2～3ml，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为3.5～4.5:1。优选地，在本发明较佳实施例中，上述溶解水为45～55℃的热水。优选地，在本发明较佳实施例中，上述二次分离干燥包括：将超声震荡后的物质进行分液，得到液体，然后将体积浓度为92～98％的乙醇与液体混合，使液体中乙醇的体积浓度为75～85％，静置22～26h，对得到的沉淀进行离心、干燥。另外，一种复配多糖，通过上述复配多糖的制备方法制得。另外，上述复配多糖在药物中的应用。另外，上述复配多糖在保健食物中的应用。相对于现有技术，本发明包括以下有益效果：本发明利用白术、茯苓作为原料，来制备多糖。脾主运化，其性喜燥恶湿，脾失健运与水湿停滞是脾胃气虚证的主要病理改变。白术、茯苓均能益气健脾，白术味甘而补中益气，苦而燥湿健脾，湿则畅达中气，暖胃醒脾；茯苓淡而能渗湿利水，甘而能健脾益气。二者按照特定的比例，配伍应用，在一定的条件下混合提取，制得的多糖实际上是白术、茯苓的多糖复配物，也就是复配多糖，其具有益气健脾、燥湿渗湿的功效，能够针对脾的病理特点，来治疗脾虚泄泻，从而增强人体免疫力。本发明提供的制备方法操作简单，制备方便，成本低，而且制得的复配多糖调理效果好。附图说明为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本发明实施例三提供的葡萄糖标准曲线。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的复配多糖及其制备方法、应用进行具体说明。复配多糖的制备方法包括步骤A：将白术、茯苓用水煎煮2～3次，每次1～2h，然后把得到的所有煎煮液混合，得到浸提液；其中，白术和茯苓的质量比为0.8～1.2:0.8～1.2，每次煎煮所用的水的质量为白术、茯苓的总质量的8～11倍。其中，白术优选菊科植物白术(Atractylodesmacrocephalakoedz.)的干燥根茎。茯苓优选为多孔菌科真菌茯苓PoriaCocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。煎煮的温度以80～100℃为宜，是在标准大气压的条件下，当然，根据地区不同，煎煮温度也会有所差异。每次煎煮所用的水的用量都是以白术、茯苓的总质量来计算，也就是说，白术用量、茯苓用量的加和为总质量，而每一次加水，水的用量都是总质量的8～11倍。而在煎煮之前，还可以利用用于第一次煎煮的水先将白术、茯苓浸泡25～35min，也就是说，先用8～11倍量(相对于白术、茯苓的总质量而言)的水浸泡白术、茯苓，然后利用该浸泡水进行煎煮。第一次煎煮后，还可以利用200～300目的滤布过滤，得到药渣和第一次的煎煮液，留用第一次的煎煮液，然后往药渣中再次加入8～11倍量(相对于白术、茯苓的总质量而言)的水，再次煎煮，过滤，如此反复2～3次，以使白术、茯苓完成2～3次煎煮，再把所有的煎煮液混合，得到浸提液，将浸提液静置20～28h，过滤，滤除浸提液中的杂质。利用用于第一次煎煮的水浸泡白术、茯苓，有助于药材中的水溶性有效成分浸提出。复配多糖的制备方法还包括步骤B：浓缩浸提液。浓缩具体为：浓缩至浸提液的质量为白术、茯苓的总质量的0.8～1.2倍。浓缩后可以静置浸提液，使其冷却。复配多糖的制备方法还包括步骤C：对浸提液进行分离，得到沉淀，再将沉淀进行干燥。分离包括：将体积浓度为92～98％的乙醇与浸提液混合，使浸提液中乙醇的体积浓度为65～75％，然后静置，直至浸提液中不再析出沉淀。乙醇的加入，能够使浸提液中析出沉淀，而多糖就存在于这沉淀之中。静置时间优选为22～26h。在得到沉淀之后，还包括：将沉淀置于3800～4200r/min的转速下，离心处理8～12min。离心处理能够实现固液分离，使沉淀与液体分开，以便得到沉淀。但若为了简化操作，不将沉淀进行离心处理，而将静置后的固液混合物进行离心处理也是可以的。在离心处理之后，还可以进行减压过滤，进一步进行固液分离，然后依次利用体积浓度为92～97％的乙醇和丙酮冲洗得到的沉淀，去除杂质，再将沉淀进行干燥。干燥时，可以在真空环境的干燥箱中，减压干燥22～24h，直至干燥的沉淀达恒重，得到粗品。当然，干燥方式并不作为限制，也可以选用其它的干燥方法，如常压干燥、喷雾干燥等。为了得到品质更好的复配多糖，在干燥之后，还包括纯化，纯化的方法可以为Sevage法(沙维积法)、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等，优选Sevage法。具体操作为：将干燥后的粗品溶于溶解水中，然后加入Sevage溶液(沙维积溶液)，超声震荡8～12min，再进行二次分离干燥；粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比为1g：8～12ml：2～3ml，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为3.5～4.5:1。粗品中的蛋白质在氯仿中变性而不溶于水，蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物而被分离，利用该方法进行纯化，纯化度高。其中，溶解水为45～55℃的热水。粗品在热水中的溶解度高，有利于后续纯化操作。超声震荡的频率以35～45KHz为佳。二次分离干燥包括：将超声震荡后的物质进行分液，得到液体，然后将体积浓度为92～98％的乙醇与液体混合，使液体中乙醇的体积浓度为75～85％，静置22～26h，对得到的沉淀进行离心、干燥。此处离心也是优选将得到的沉淀置于3800～4200r/min下离心8～12min。另外，纯化的操作重复2～3次为佳。在分液之后，可以利用玻沙漏斗进行减压过滤，然后再将得到的液体与乙醇混合。而因为多糖易溶于水，利用乙醇再与液体混合，能够使得前面步骤中溶于水的多糖从液体中析出。而此时，其会存在于析出的沉淀中。再将沉淀减压过滤，然后干燥，即得到多糖成品。本发明还提供了通过上述复配多糖的制备方法制得的复配多糖。本发明还提供了复配多糖在药物中的应用，也提供了复配多糖在保健食物中的应用。当复配多糖应用于药物中时，其可以制成颗粒剂型、片剂、胶囊等各种剂型，也可以作为中间药物进行应用。而食物包括了固态或液态的可食用物质，所以复配多糖在保健食物中的应用是包括了其在保健食品、保健饮品中的应用。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：实施例一本实施例提供的复配多糖的制备方法，包括以下步骤：a.按照0.8:1.2的质量比取用白术和茯苓，得到药材总质量，然后将白术和茯苓放入锅中，加入药材总质量的8倍的水，煎煮1h，然后滤出煎煮液，将过滤的药渣保留在锅中，再次加药材总质量的8倍的水，煎煮1h，再次滤出煎煮液，将两次得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.对浸提液进行浓缩，直至浸提液的质量为药材总质量的0.8倍；c.往步骤b得到的浸提液中加入体积浓度为92％的乙醇，直至浸提液的体积浓度为65％，然后静置，直至浸提液中不再析出沉淀，分离出沉淀，并将沉淀干燥至前后两次称重之差为0.05mg。本实施例还提供了上述制备方法制得的复配多糖。实施例二本实施例提供的复配多糖的制备方法，包括以下步骤：a.按照1.2:0.8的质量比取用白术和茯苓，得到药材总质量，然后将白术和茯苓放入锅中，加入药材总质量的11倍的水，煎煮2h，然后滤出煎煮液，将过滤的药渣保留在锅中，再次加入药材总质量的11倍的水，煎煮2h，再次滤出煎煮液，将两次得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.对浸提液进行浓缩，直至浸提液的质量为药材总质量的1.2倍；c.往步骤b得到的浸提液中加入体积浓度为98％的乙醇，直至浸提液的体积浓度为75％，然后静置，直至浸提液中不再析出沉淀，分离出沉淀，并将沉淀干燥至前后两次称重之差为0.2mg；d.将干燥后的粗品溶于55℃的热水中，然后加入Sevage溶液，超声震荡12min，再进行分液，得到液体，然后将体积浓度为98％的乙醇与液体混合，使液体中乙醇的体积浓度为85％，静置26h，对得到的沉淀再次干燥；其中，粗品、溶解水、Sevage溶液的用量比为1g：12ml：3ml，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为4.5:1。本实施例还提供了上述制备方法制得的复配多糖。实施例三本实施例提供的复配多糖的制备方法，包括以下步骤：a.分别取用白术、茯苓各100g，混合，用2000ml水浸泡30min，然后煎煮1h，再用250目的滤布过滤，得到滤渣和煎煮液，将煎煮液留待备用，将滤渣倒入容器中，加入2000ml水煎煮1h，再次过滤，得到煎煮液，将两次得到的煎煮液混合，静置24h，过滤，得到的滤液作为浸提液；b.将浸提液浓缩至200ml，静置，冷却至自然温度；c.往浸提液中缓慢的加入体积浓度为95％的乙醇，并且边添加边搅拌，直至浸提液中乙醇的浓度为70％，接着静置24h，然后在4000r/min的转速下离心10min，减压过滤，得到沉淀，再依次用体积浓度为95％的乙醇和丙酮冲洗沉淀，将沉淀置于真空干燥箱中减压干燥24h，直至前后两次称重之差为0.15mg，得到复配多糖粗品。本实施例中，粗品收率参见表1：表1编号药材量粗多糖含量粗多糖收率粗品200g28.52g14.26％本实施例中，还利用硫酸蒽酮法对复配多糖粗品进行了含量测定，其中，所使用的试剂包括蒽酮、无水葡萄糖对照品，所使用的仪器包括UV-1100型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)、循环水真空泵、电子天平、水浴锅，操作如下：1.供试品溶液的配制：取粗品(0.1000g)，于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解，振摇，并定容至100ml，水浴加热2min，直至溶液澄清，待溶液冷却至室温后，再精密移取2.5ml于另外1个25ml容量瓶中，加蒸馏水定容至25ml，振摇。得到样品溶液，备用。2.对照品溶液的配制：(1)取无水葡萄糖对照品于减压干燥箱中干燥24h后，备用。(2)取于105℃干燥好的葡萄糖对照品0.0100g于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解，振摇，并定容至100ml。编号为标准葡萄糖对照品溶液。样品溶液和对照品溶液数据如表2：表23.蒽酮试剂的配制：取蒽酮0.2g，加入100ml体积浓度为98％的硫酸中，现配现用。4.标准曲线的制备以及白术茯苓总多糖的含量测定：(1)对照品溶液：用移液枪分别取标准葡萄糖对照品溶液0.5ml、0.6ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml于8支试管中，各用蒸馏水补至2ml，分别向8支试管中加入8ml蒽酮试剂，振摇，混匀。编号为①，②，③，④，⑤，⑥，⑦，⑧号。(2)供试品溶液：用移液管取样品溶液1.0ml于10ml试管中，用蒸馏水补至2ml，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。为⑨号。(3)空白溶剂：精密移取2.0ml蒸馏水于10ml试管中，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。为⑩号。(4)将上述10支试管至沸水浴中加热10min，迅速移至冰水浴中，冷却至室温。(5)参照紫外-可见分光光度法(《中国药典2010版》附录VA)在400～800nm波长范围进行扫描，选取最大吸收波长为测定波长。结果为：对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长分别为624.2nm和627.1nm，因此，综合考虑之后确定测定的最佳波长为625nm。(6)在最佳吸收波长625nm下，分别测定①～⑧号的吸光度。结果参见表3：表3而葡萄糖标准曲线参见图1，其中Y＝4.5651X，R2＝0.9983。(7)根据回归方程计算纯多糖含量表4编号粗多糖含量纯化多糖含量收率⑨0.10mg0.06199mg61.99％为了得到品质更好、收率更高的复配多糖，本实施例还进行了纯化实验：1.TCA(三氯乙酸)-正丁醇法：取本实施例制得的粗品5g于50mL热水中，得到液体，再加入液体体积2倍的TCA-正丁醇(体积比1:10)混合液中，搅拌50min，然后倒入分液漏斗中静置1.5h，分出下层清液，用玻沙漏斗抽滤，再往清液中加入体积浓度为95％乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，2.4g，记为1号。2.TCA法：取本实施例制得的粗品5g于50mL热水中，再加入50mL体积浓度为10％的TCA溶液，搅拌30min，静置过夜，然后在4000r/min下离心10min，取上清液，利用NaOH固体调pH值至7.0。再用玻沙漏斗抽滤，往抽滤得到的液体中加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，无物质。为2号。3.TCA-Sevage法：取本实施例制得的粗品5g于50mL热水中，然后加入50mL体积浓度为10％的TCA溶液和10mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，搅拌1h，在4000r/min下离心10min，取上清液，用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，再称取少量配成溶液，用硫酸蒽酮法测多糖含量。无物质，为3号。4.Sevage法：(1)取本实施例制得的粗品3.5g于35mL热水中，再加入7mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，搅拌20min，在4000r/min的转速下离心10min，取水层。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，2.51g，为4号。(2)取本实施例制得的粗品2g于20mL热水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，充分震荡15min，用分液漏斗分离，取水层，重新加入5mlSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，重复3次。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，1.25g，为5号。(3)取本实施例制得的粗品2g于20mL热水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，超声10min，再用分液漏斗分离，重复3次。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，1.64g，为6号。5.TCA直溶法(1)取本实施例制得的粗品5g于50mLTCA溶液(体积浓度为10％)中，搅拌30min，静置过夜，在4000r/min的转速下离心10min，取上清液，用NaOH固体调pH值至7.0。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，为0.2g，为7号。(2)取本实施例制得的粗品5g于50mLTCA溶液(体积浓度为20％)中，搅拌30min，静置过夜，在4000r/min的转速下离心10min，取上清液，用NaOH固体调pH值至7.0。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，为0.2g，为8号。(3)取本实施例制得的粗品5g于50mLTCA溶液(体积浓度为40％)中，搅拌30min，静置过夜，在4000r/min的转速下离心10min，取上清液，用NaOH固体调pH值至7.0。用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，为0.38g，为9号。将上述1～9号复配多糖的回收率进行比较，结果参见表5：表5编号样品量纯化量回收率15g2.4g48.00％25g0035g0043.5g2.51g71.71％52g1.2562.50％62g1.64g82.00％75g0.2g4.00％85g0.2g4.00％95g0.38g4.00％由上可知，1、4、5、6四个样品具有测试价值，将这四个样品按照以下方法进行紫外可见光检测。分别称量1、4、5、6四个样品0.1000g于80ml蒸馏水中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml，水浴中加热2min至溶液澄清，待溶液冷却至室温后，再各精密移取2.5ml于另外1个25ml容量瓶中，加蒸馏水定容至25ml，振摇，分别标号为样品1号、样品4号、样品5号、样品6号。蒽酮试剂的配制：取蒽酮0.2g，加入100ml体积浓度为98％的硫酸，现配现用。样品试剂用移液管取溶液，样品1号、样品4号、样品5号、样品6号分别移取1.0ml于10ml的试管中，用蒸馏水补至2ml，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。分别为溶液1号、溶液4号、溶液5号、溶液6号。空白溶剂：精密移取2.0ml蒸馏水于10ml容量瓶中，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。为⑩号。测试结果参见表6：表6编号吸光度粗多糖含量溶液1号0.2870.10mg溶液4号0.2980.10mg溶液5号0..2990.10mg溶液6号0.2680.10mg溶液1号、溶液4号、溶液5号、溶液6号所用的配制原料的性质参见表7：表7标号样品量纯多糖量收率样品1号0.10mg0.06283mg62.83％样品4号0.10mg0.06528mg65.28％样品5号0.10mg0.06550mg65.60％样品6号0,10mg0.05871mg58.71％综合比较几种方法，Sevage法更具有实用提取价值，那么再分别试验离心1次、2次、3次多糖纯度的大小。1.取粗品两份，每份2g，分别溶于20ml蒸馏水中，标为S2、S3，再分别加入4mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，搅拌20min，超声震荡后再在4000r/min的转速下离心10min，取水层。S2重复上述操作(加入Sevage溶液～取水层)2次，S3重复上述操作(加入Sevage溶液～取水层)3次，然后分别用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，S2为1.4g，标为10号，S3为1.1768g，标为11号。2.取粗品2g于16mL热水中，再加入3mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，搅拌20min，超声震荡后再在4000r/min的转速下离心10min，取水层。继续重复上述操作3次，然后用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，1.2g，标为12号。3.取粗品2g于26mL热水中，再加入5mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，搅拌20min，超声震荡后再在4000r/min的转速下离心10min，取水层。继续重复上述操作3次，然后用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，1.39g，标为13号。将4号、10～13号复配多糖进行比较，结果如表8：表8编号样品量纯化量回收率43.5g2.51g71.71％102g1.4g70.00％112g1.1765g56.83％122g1.2g60.00％132g1.39562.98％再按照以下操作进行紫外可见光测试。分别称量10号、11号、12号、13号四个样品0.1000g于80ml蒸馏水中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml，水浴中加热2min至溶液澄清，待溶液冷却至室温后，再各精密移取2.5ml于另外1个25ml容量瓶中，加蒸馏水定容至25ml，振摇，分别标号为样品10号、样品11号、样品12号、样品13号。蒽酮试剂的配制：取蒽酮0.2g，加入100ml体积浓度为98％的硫酸，现配现用。样品试剂用移液管取溶液，分别移取样品10号、样品11号、样品12号、样品13号的1.0ml于10ml试管中，用蒸馏水补至2ml，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。分别为溶液10号、溶液11号、溶液12号、溶液13号。空白溶剂：精密移取2.0ml蒸馏水于10ml容量瓶中，加入蒽酮8ml，振摇，混匀。为⑩号。测试结果参见表9：表9编号吸光度A粗多糖含量溶液10号0.3070.10mg溶液11号0.3310.10mg溶液12号0..3210.10mg溶液13号0.3850.10mg溶液4号、溶液10号、溶液11号、溶液12号、溶液13号所用的配制原料的性质参见表10：表10由上表可知，复配多糖的纯化含量能够达到84％以上。实施例四本实施例提供的复配多糖的制备方法，包括以下步骤：a.取用白术、茯苓各1000克，用水煎煮2次，每次1.5h，每次的水的用量为白术、茯苓总质量的10倍，煎煮完成后，将所有得到的煎煮液混合，得到浸提液；b.将浸提液浓缩至2000ml；c.往浓缩后的浸提液中加入体积浓度为95％的乙醇，使浸提液中的乙醇浓度为70％，静置，直至浸提液中不再析出沉淀，然后在4000r/min的转速下离心10min，干燥，得到粗品290g；d.取粗品290g于2900mL温度为50℃的热水中，再加入725mLSevage(氯仿：正丁醇＝4：1)溶液，超声震荡10min，再利用分液漏斗进行分液，用玻沙漏斗抽滤，再加入体积浓度为95％的乙醇，配成体积浓度为80％的醇溶液，静止24h，对沉淀进行抽滤，烘干，称重量，得到238g复配多糖。本实施例中，利用上述制得的复配多糖进行以下试验：1.小鼠碳粒廓清试验实验药物：复配多糖，棕黄色粉末，无特殊气味。临用前用蒸馏水分别配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml备用；人参总皂苷，阳性药物，为黄色粉末，有特殊气味，用前用蒸馏水配置成0.25g/ml备用。实验动物：昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，质量合格证号SCXK(川)2013-19。实验试剂和仪器：墨汁(使用前用生理盐水稀释4倍)、Na2CO3(使用前用蒸馏水配成0.1％)、1ml注射器、计时器、电子天平、紫外分光光度计。实验方法：取健康合格昆明小鼠50只，雌雄各半，待适应环境后，按体重随机分为阳性对照组、正常对照组和复配多糖高、中、低剂量组(N＝10)。首次给药前禁食不禁水12h，然后各组开始灌胃给药，其中阳性对照组灌胃人参总皂苷，正常对照组灌胃蒸馏水，实验组灌胃相应计量的受试药物，给药体积均为10ml/kg，每日1次，连续4周。每周称体重、饮食进水量1次。末次给药前进行称重，给药后1h，各组小鼠尾静脉注射稀释的墨汁10ml/kg，注射完后立即计时。注入墨汁后2min、10min时，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到装有2mL0.1％Na2CO3溶液的离心管中混匀。将小鼠处死，取肝脏、脾脏用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脏器系数。分别吸取得到的血液样品200ul置于96孔板中，利用全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD)。以吞噬指数表示小鼠碳粒廓清的能力。按下式计算吞噬指数a：(注：t1、t2分别指2min、10min)实验结果：与空白组比较，复配多糖高、中、低剂量组和人参总皂苷组小鼠体重与空白组无明显差异；同时，各给药组的吞噬系数K和吞噬指数a增较空白组升高，其中复配多糖高、中剂量组K值和高剂量组a值显著高于空白组(P<0.05)，人参总皂苷组K值、a值较空白组有升高趋势。结果详见表11。表11表11复配多糖对小鼠碳粒廓清吞噬指数的影响注：与空白组比较，*P<0.05。2.小鼠脏器称重试验实验药物：复配多糖，棕黄色粉末，无特殊气味。临用前用蒸馏水分别配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml备用；人参总皂苷，阳性药物，为黄色粉末，有特殊气味，用前用蒸馏水配置成0.25g/ml备用。实验动物：昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重15-18g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，质量合格证号SCXK(川)2013-19。实验试剂和仪器：电子天平(Mettlertoledo，AL104型)，手术器械。实验方法：取健康合格昆明小鼠50只，雌雄各半，待适应环境后，按体重随机分为阳性对照组、正常对照组和复配多糖高、中、低剂量组(N＝10)。首次给药前禁食不禁水12h，然后各组开始灌胃给药，其中阳性对照组灌胃人参总皂苷，正常对照组灌胃蒸馏水，实验组灌胃相应计量的受试药物，给药体积均为10ml/kg，每日1次，连续4周。每周称体重、饮食进水量1次。末次给药后1h，处死小鼠，取其肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脏器系数。实验结果：与空白组比较，复配多糖高、中、低剂量组对幼年小鼠的肝脏、脾脏指数无明显影响，人参总皂苷可明显升高肝脏指数(P<0.05)，对脾脏指数无明显影响。结果见表12。表12复配多糖对幼年小鼠脏器指数的影响注：与空白组比较，*P<0.05。3.小鼠环磷酰胺致免疫低下试验实验动物：昆明种小鼠，SPF级，体重18～22g，雌雄各半，由四川省中医药科学院实验动物研究中心提供，质量合格证号：SCXK(川)2013-19。实验药物：复配多糖，棕黄色粉末，无特殊气味。临用前用蒸馏水分别配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml备用；人参总皂苷，阳性药物，为黄色粉末，有特殊气味，用前用蒸馏水配置成0.25g/ml备用。环磷酰胺，造模药物，sigma生产国内分装，以生理盐水配成4mg/kg备用。主要试剂和仪器：血细胞分析仪溶血剂，由上海东湖生物医学有限公司生产，批号为20140318；MEK-6318K血细胞分析仪，日本光电生产。实验方法：取正常、合格昆明种小鼠，按体重随机分为正常对照组、模型对照组、人参总皂苷组、复配多糖高剂量组、复配多糖中剂量组、复配多糖低剂量组(N＝10)。待适应环境后，各组小鼠灌胃相应药液，10ml/kg，每日1次，连续10天。于灌胃第1、3、5、7、9天，在灌胃前给予皮下注射环磷酰胺50mg/kg。隔日称重1次。末次给药后24h，称重后，各组小鼠摘眼球取血，采用血细胞分析仪测定外周血中WBC、RBC、HGB、PLT数量；然后处死小鼠，剖取胸腺、脾脏和肝脏，称重，计算脏器系数。实验结果(1)对外周血WBC、RBC、HGB、PLT数量的影响：与正常对照组比较，经给予环磷酰胺后，模型对照组小鼠外周血RBC、HGB数量明显下降，PLT数量则明显升高，有统计学意义(P<0.05)，WBC数亦明显下降，但无统计学意义；各给药组小鼠RBC、HGB数量也明显低于正常对照组；与模型对照组比较，复配多糖中、低剂量组RBC、HGB有升高趋势，且对PLT的升高作用有统计学意义(P<0.05)，人参总皂苷和复配多糖高剂量组对上述各指标无明显影响，与模型对照组比较无显著性差异。结果见表13。表13复配多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠血细胞的影响注:与正常对照组比较,*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，##P<0.01。△因取血液标本失败或检测时试剂缺失，正常对照组2只无检测数据，高剂量组3只无检测数据。实验结果(2)对胸腺、肝脏、脾脏系数的影响：与正常对照组比较，模型对照组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著下降(P<0.01)，肝脏指数则呈升高趋势；各给药组的胸腺指数和脾脏指数亦明显低于正常对照组(P<0.01)。与模型对照组比较，复配多糖高、中、低剂量组及人参总皂苷组小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数均无明显变化，其中复配多糖高、中、低剂量组肝脏指数略有降低，接近正常对照组。结果见下表14。表14复配多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠胸腺指数的影响注：与正常对照组比较，**P<0.01。4.脾淋巴细胞增殖试验实验药物：复配多糖，棕黄色粉末，无特殊气味。临用前用蒸馏水分别配置成0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml备用；人参总皂苷，阳性药物，为黄色粉末，有特殊气味，用前用蒸馏水配置成0.25g/ml备用。实验动物：昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18-22g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，质量合格证号SCXK(川)2013-19。实验试剂和仪器：多功能酶标仪，美国Thermo公司，型号VARIOSKANFLASH2.4.3；RPMI1640细胞培养液，由赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司生产，批号NZM1289；胎牛血清，由呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司生产，批号141103；青霉素，由华北制药股份有限公司生产，批号F3107204；链霉素，由华北制药股份有限公司生产，批号20141102；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma分装，批号11028-71-0；盐酸，由四川西陇化工有限公司生产，批号140818；MTT，Sigma分装，批号M-2128；PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，由无锡傲锐东源生物科技有限公司生产，批号140511；纱布，由江苏米沙瓦医疗用品有限公司生产，批号14040；200目筛网；24孔培养板，96孔培养板，均由costar生产；超净工作台，由苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产，批号SW-CJ-2FD；HVE-50高压灭菌器，HIRAYAMA生产。实验方法(1)灌胃复配多糖小鼠脾淋巴细胞增殖试验：取健康合格昆明小鼠20只，雌雄各半，待适应环境后，按体重随机分为正常对照组、阳性对照组和复配多糖高、中、低剂量组(N＝4)。首次给药前禁食不禁水12h，然后各组开始灌胃给药，其中阳性对照组灌胃人参总皂苷，正常对照组灌胃蒸馏水，实验组灌胃相应计量的受试药物，给药体积均为10ml/kg，每日1次，连续4周。每周称体重、饮食进水量1次。末次给药后1h，各组小鼠取两只用于无菌取脾，置于盛有5ml无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。然后将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2、37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡(2秒)或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装2孔作为平行样，在570nm波长测定光密度值。同时，取脾之前，各组在末次给药后1h，4只小鼠均无菌条件下摘眼球采血，3500rpm心离心10min，取血清，于56℃灭活30min，分装，用于试验。另取正常未给药小鼠2只，无菌取脾，按上述方法培养脾淋巴细胞，给予刀豆蛋白的同时，给予各含药血清，使血清终浓度为10％，继续培养4h，按上述方法测定吸光值。实验结果(1)对灌胃复配多糖小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响：与空白组比较，人参总皂苷组和复配多糖中剂量组脾淋巴细胞活力下降，但复配多糖低剂量组细胞OD值明显升高，均有显著性差异(P<0.01)，复配多糖高剂量组作用不明显。结果见下表15。表15复配多糖对刀豆蛋白诱导的脾细胞转化的影响注:与空白组相比较,**P<0.01，差异有极显著性。实验结果(2)复配多糖含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响：从表16可见，经刀豆蛋白诱导后，脾淋巴细胞活力增加，但给予不同药物浓度的含药血清和人参总皂苷含药血清，其对脾淋巴细胞活力均无明显影响，重复试验1次，结果一致。表16复配多糖含药血清对刀豆蛋白诱导的脾细胞转化的影响(第一批)本领域的技术人员根据上述体外细胞实验、动物模型实验结合现有技术能够预期制得的复配多糖具有较好的调理效果，能够增强人体免疫力。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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