专利名称：一种隐孔菌多糖及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种隐孔菌多糖及其制备方法，以及这种隐孔菌多糖在制备治疗过敏性鼻炎、过敏性哮喘和成人型呼吸窘迫综合征药物中的应用。
背景技术：
隐孔菌俗名松橄榄、树荷苞、树疙瘩、荷色菌、木鱼菌、香木兰、黑迈子(云南)、一口茸(日本)。属于真菌界、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶目[Aphyllophorales，旧系统作多孔菌目(Polyporales)]、多孔菌科(Polyporaceae)、隐孔菌属(Cryptoporus)。分布于中国的四川、江苏、浙江、湖北、吉林、云南、海南、福建等省，朝鲜、日本、欧洲、北美洲也有分布。
关于隐孔菌的药用价值早有报道，蓝茂(1397-1476)《滇南本草》记载味苦、甘，性微寒。治大肠下血，积热之毒。疗(内外)九种痔疮，(附方)治牙齿疼，将松橄榄于疼牙上咬住，疼即止。韩国李氏等人(1981)得到的热水提取物中的多糖蛋白具有抗癌活性。江苏省植物研究所等编著(1990)的《新华本草纲目》记载味微苦，性平。有止咳、平喘、解毒等功能。用于治气管炎、哮喘，还可用于小儿断奶(云南丽江民间常用)，徐锦堂等编《中国药用真菌学》(1997)第三十二章隐孔菌全面记载了隐孔菌的国内外的报道、药用价值、形态结构、生活习性、生活史、生活条件、培养技术等。
关于隐孔菌的人工栽培未见报道，但华启洪等对隐孔菌的液体发酵培养进行了研究，并申请了中国专利(专利号94117227.9)，而后杭州泰士生物技术有限公司对隐孔菌的液体发酵技术和药用价值进行了进一步研究，发现隐孔菌的液体发酵物对过敏性哮喘和过敏性鼻炎有很好的疗效，并中请了中国专利(已公开01126498.5)。
关于隐孔菌的化学成分也有报道华启洪、金国梁等《中国药学杂志》1993.28(2)P75～76报道了隐孔菌19种挥发油成分研究；华启洪、金国梁等《植物资源与环境》1993.2(1)P60～61报道了隐孔菌糖、氨基酸、微量元素等化学成分研究；马伟光等《云南植物研究》1994.16(2)P196～200报道了从野生隐孔菌中分离的四个麦角甾醇类化合物；吴锦忠、黄年来《福建中医学院学报》1997.7(2)P21～26报道了隐孔菌发酵培养物和野生隐孔菌中氨基酸、糖类和水提取物、乙醇提取物、石油醚提取物之间的薄层分析结果比较。
但对于隐孔菌的有效成分研究的很少。
发明内容本发明即是为了提供一种隐孔菌多糖及制备方法，和这种隐孔菌多糖在制备治疗过敏性鼻炎、过敏性哮喘和成人型呼吸窘迫综合征药物中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种隐孔菌多糖(CFSP)，所述隐孔菌多糖由含隐孔菌或隐孔菌发酵物的原料提取制得，分子量范围为2000～200000，主要由甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖四种单糖组成，主链由1→6连接的甘露糖，1→6连接的半乳糖，1→3连接的岩藻糖和1→4、1→3连接的木糖构成。
所述隐孔菌多糖可由如下方法制备得到将含隐孔菌多糖的原料加水提取，水提液浓缩后加入聚乙二醇(PEG)混匀，静置沉淀，取沉淀物用乙醇洗涤，沉淀物水溶，离心后去除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥得隐孔菌多糖。
所述的含隐孔菌多糖的原料为下列之一或下列两种或两种以上任意形式的组合①天然隐孔菌；②隐孔菌液体培养液；③隐孔菌菌丝体；④隐孔菌固体培养物；⑤隐孔菌菌粉。
一种制备上述隐孔菌多糖的方法，所述的方法如下将含隐孔菌多糖的原料加水提取，水提液浓缩后加入聚乙二醇(PEG)混匀，静置沉淀，取沉淀物用乙醇洗涤，沉淀物水溶，离心后去除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥得隐孔菌多糖。
进一步，所述的方法如下将含隐孔菌多糖的原料加入5～10质量倍的水，70～90℃下提取1～4小时，水提液离心得上清液浓缩至比重为1.0～1.3，得浓缩液，每100mL浓缩液加入聚乙二醇5～50g，充分搅拌后静置过夜沉淀，离心得沉淀物用95％乙醇洗涤，沉淀物水溶、离心后去除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥即得所述的隐孔菌多糖。
上述方法中，所述的含隐孔菌多糖的原料为下列之一或下列两种或两种以上任意形式的组合①天然隐孔菌；②隐孔菌液体培养液；③隐孔菌菌丝体；④隐孔菌固体培养物；⑤隐孔菌菌粉。
目前提取纯化多糖的方法主要有1)乙醇沉淀法这种方法使用最普遍，也最具有通用性，但是操作能耗高，需要乙醇量大，费时费力，得率低。2)超滤法通过超滤膜截留提取一定分子量的多糖。这种方法也有很广的应用范围，能耗低，提取速度快，不需要有机溶剂。但是提取的多糖含量低，多种分子量物质残留高。3)络合法这种方法主要利用某些酸性多糖的特异结合性加入络合剂使之析出，常用的络合剂有氯化钙、硫酸铜、十六烷基三甲基溴化铵等。这种方法能耗低，提取的多糖含量较高，但应用范围窄，仅限于酸性多糖或者某些特性的杂多糖。4)柱分离法这种方法利用各种柱填料性质的差异来纯化多糖。比如目前流行的大孔树脂纯化多糖，离子交换纯化糖蛋白等等。这种方法提取的多糖纯度较高，但是操作复杂，对柱子进行预处理，分步洗脱，柱子的再生，生产过程中大量的废液处理等，得率低，成本高。且提取物常含有柱料残留物，如大孔树脂提取后的多糖要检测甲苯、二甲苯的残留量。
本发明所采用的提取方法是用PEG沉淀多糖，具体的说就是将含隐孔菌多糖的原料水提，加入聚乙二醇(PEG)，搅拌，溶解，静置，沉淀，离心得沉淀物，沉淀物用95％乙醇洗涤，沉淀物水溶，离心，蛋白酶水解，煮沸，离心，膜分离，浓缩后干燥得质量含量在50％以上的隐孔菌多糖。本发明所解决的技术难点在于如何从水提取液中分离出粗多糖。发现用PEG沉淀多糖所得产品多糖含量要远高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量仅为乙醇用量的二十分之一左右，所以本发明得率高，含量高，成本低，且操作简便。本发明中所用95％乙醇指乙醇体积百分含量为95％的水溶液。
所述的聚乙二醇优选为PEG1000～20000。
所述的去除蛋白质方法可以是蛋白酶解如内切酶、外切酶或复合酶，减小蛋白质的分子量并使与糖结合的蛋白游离出来，也可以用有机溶剂如三氯乙酸，大孔树脂吸附，加重金属盐，煮沸等方法沉淀蛋白质。本发明中优选为为蛋白酶水解。
优选的，所述的方法如下隐孔菌菌粉加入5倍质量的水，80℃提取2小时，提取液取上清液；沉淀加适量水充分搅拌提取，提取液离心得上清液，两次上清液合并，减压浓缩至体积缩小一倍得浓缩液，不断搅拌下，每100mL浓缩液加入15克PEG6000，搅拌使充分溶解，室温放置过夜，使沉淀完全，离心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本无色，得沉淀溶解于适量水中，离心除去不溶物，上清加蛋白内切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室温，离心除去不溶物，上清用截流分子量50万的超滤膜过滤，滤液用截流分子量2万的超滤膜浓缩，浓缩液冻干即得所述的隐孔菌多糖。
或者，所述的方法如下天然隐孔菌粉碎后加入2.5倍质量的水，80℃提取2小时，提取液得上清液；沉淀加适量水充分搅拌提取，提取液离心取上清液，两次上清液合并，减压浓缩至体积缩小一倍得浓缩液，不断搅拌下，每100mL浓缩液加入25克PEG20000，搅拌使充分溶解，室温放置过夜，使沉淀完全，离心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本无色，得沉淀溶解于适量水中，离心除去不溶物，上清加蛋白内切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室温，离心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小时，透析内液用0.45微米的膜过滤后60℃蒸干即得所述得隐孔菌多糖。
所述的隐孔菌多糖可应用于制备治疗过敏性鼻炎药物、过敏性哮喘药物以及成人型呼吸窘迫综合征药物，当然也可将这种隐孔菌多糖用于制成食品、保健食品或食品添加物，应用于过敏性鼻炎、过敏性哮喘、及成人型呼吸窘迫综合征的病人。所述的药物可制成胶囊、片剂、颗粒剂、口服液、注射液等多种人体可接收的剂型。
过敏性鼻炎和哮喘在免疫学发病机制上非常相近，致敏原可分别在上下呼吸道激发相似的组织病理学反应，鼻腔和支气管粘膜均有大量表达Th2细胞因子的辅助性T细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润，同时产生的组胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子、趋化因子和缓激肽等炎性介质，在上呼吸道和下呼吸道引发相似的炎性反应过程。对患者进行鼻部变应原激发试验后，下呼吸道粘膜中嗜酸性粒细胞浸润增加，同时表达粘附分子的细胞数量增加，表明局部粘膜的变应性炎症反应可能在其它部位产生相似的反应。隐孔菌多糖能够显著抑制嗜酸性粒细胞是其治疗过敏性鼻炎和哮喘的机制之一。
成人型呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)是由急性肺损伤引起的呼吸衰竭。其发病机制很复杂，目前认为是大量中性粒细胞在趋化因子及粘附分子作用下聚集于肺、粘附于肺泡毛细血管内皮，释放氧自由基、蛋白酶和炎症介质等，损伤肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞。肺泡毛细血管膜的损伤及炎症介质的作用使肺泡上皮和毛细血管内皮通透性增高，引起渗透性肺水肿，致使肺弥散功能障碍。成人型呼吸窘迫综合征的发病特征是中性粒细胞的聚集。隐孔菌多糖能够显著抑制多形核白细胞的聚集、多核粒细胞和淋巴单核细胞的聚集，是治疗成人型呼吸窘迫综合征的机制之一。
本发明从隐孔菌发酵物中提取一种杂多糖(CFSP)，通过采用对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞(嗜酸性粒细胞EOS)的影响的药效学研究为指标，确认了这种杂多糖是隐孔菌发酵物中的主要药效成分；通过Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症的抗炎作用实验进一步证实了此隐孔菌多糖是隐孔菌发酵物中的主要活性成分。
进而对此杂多糖进行了结构研究，发现此多糖主要由甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖四种单糖组成，其分子中主链由1→6连接的甘露糖，1→6半乳糖，1→3连接的岩藻糖和1→4、1→3连接的木糖组成。
CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎症细胞聚集，与模型组相比，P＜0.05～0.001，见
图1。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)和静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了腹腔内多形核白细胞的聚集，P＜0.05～0.01，结果见图2。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了多核粒细胞和淋巴单核细胞的聚集，与模型组相比，P＜0.05～0.001，见图3。
本发明所述的隐孔菌多糖及其制备与应用的有益效果主要体现在(1)本发明所述隐孔菌多糖细化了具体药效成分，能非常显著地抑制致敏大鼠抗原攻击后肺部嗜酸性炎症的作用；显著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎症细胞聚集，多形核白细胞的聚集，多核粒细胞和淋巴单核胞的聚集。更明确指出了隐孔菌多糖具体的药效成分，可以开发成新药或功能性食品或保健品用于过敏性鼻炎和过敏性哮喘及成人型呼吸窘迫综合征，具有广阔应用前景；(2)所述隐孔菌多糖制备方法用PEG沉淀多糖所得产品多糖含量要远高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量仅为乙醇用量的二十分之一左右，得率高，含量高，成本低，且操作简便。
(四)说明书附1为CFSP1、CFSP2、CFSP3及地塞米松对Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔白细胞总数的抑制作用；(T检验，mean±SD；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与CFSP1组(10mg/kg，iv)比较##P＜0.01，###P＜0.001)图2为CFSP1、CFSP2、CFSP3及地塞米松对Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症细胞分类的影响；(T检验，mean±SD；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)图3为CFSP1、CFSP2、CFSP3对多核粒细胞和淋巴单核细胞的影响，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与CFSP1(10mg/kg，iv)组比较##P＜0.01，###P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例1隐孔菌多糖的制备取隐孔菌菌粉2000克，加入10升水，80℃提取2小时。提取液3500转/分离心10分钟，得上清液1。沉淀加2升水，充分搅拌提取，3500转/分离心10分钟，得上清液2。将上清液1与上清液2合并，减压浓缩至约6升，在不断搅拌下加入1000克PEG6000，继续搅拌1小时使PEG充分溶解。室温放置过夜，使沉淀完全，然后将溶液3500转/分离心10分钟，得沉淀，弃上清。沉淀用95％乙醇在索氏提取器中回流提取6小时至提取液基本无色，挥干沉淀中的乙醇，称重，得沉淀82克。将沉淀用2升水溶解，3500转/分离心除去不溶物，上清加500mg蛋白内切酶，调节合适的pH值和温度，水解5小时后把水解液煮沸10分钟，放冷至室温，3500转/分离心除去不溶物，上清用截流分子量50万的超滤膜过滤，滤液用截流分子量2万的超滤膜浓缩，浓缩液冻干得隐孔菌多糖46克。用硫酸-苯酚法测量结果为总多糖含量87％，颜色灰白，易溶于水，分子量分布20,000～200,000。
实施例2隐孔菌多糖的制备取天然隐孔菌200克，粉碎，加入500毫升水，80℃提取2小时。提取液3500转/分离心10分钟，得上清液1。沉淀加200毫升水，充分搅拌提取，3500转/分离心10分钟，得上清液2。将上清液1与上清液2合并，减压浓缩至约200毫升，在不断搅拌下加入50克PEG20000，继续搅拌1小时使PEG充分溶解。室温放置过夜，使沉淀完全，然后将溶液3500转/分离心10分钟，得沉淀，弃上清。沉淀用95％乙醇在索氏提取器中回流提取6小时至提取液基本无色，挥干沉淀中的乙醇，称重，得沉淀4.2克。将沉淀用200毫升水溶解，3500转/分离心除去不溶物，上清加50mg蛋白内切酶，调节合适的pH值和温度，水解5小时后把水解液煮沸10分钟，放冷至室温，3500转/分离心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小时，透析内液用0.45微米的膜过滤后60度蒸干即得隐孔菌多糖2克。用硫酸-苯酚法测量结果为总多糖含量65％。
实施例3隐孔菌多糖的制备取隐孔菌菌丝体2000克，加入10升水，80℃提取2小时。提取液3500转/分离心10分钟，得上清液1。沉淀加2升水，充分搅拌提取，3500转/分离心10分钟，得上清液2。将上清液1与上清液2合并，减压浓缩至约1升，在不断搅拌下加入200克PEG6000，继续搅拌1小时使PEG充分溶解。室温放置过夜，使沉淀完全，然后将溶液3500转/分离心10分钟，得沉淀，弃上清。沉淀用95％乙醇回流提取6小时，提取后的沉淀烘干，称重，得沉淀8.2克。将沉淀用500毫升水溶解，3500转/分离心除去不溶物，上清加100mg蛋白内切酶，调节合适的pH值和温度，水解5小时后把水解液煮沸10分钟，放冷至室温，3500转/分离心除去不溶物，上清用截流分子量50万的超滤膜过滤，滤液用截流分子量2万的超滤膜浓缩，浓缩液冻干得隐孔菌多糖4克。用硫酸-苯酚法测量结果为总多糖含量88％，颜色灰白，易溶于水，分子量分布20,000～200,000。
实施例4取实施例1中的隐孔菌多糖50克，加淀粉45.5克、药用二氧化硅0.5克，混匀，装胶囊1000粒，即得隐孔菌多糖胶囊(每粒含隐孔菌多糖50mg)。
实施例5
将400克蔗糖用热溶法制成单糖浆，备用。取实施例1所得隐孔菌多糖5克，加水溶解，稀释至2000毫升，加入单糖浆及山梨酸8克，混匀，加水至5000毫升，分装，灭菌，即得隐孔菌多糖口服液(1mg/ml)。
实施例6取实施例1中的隐孔菌多糖0.5克，奶粉5千克，混匀，分装，即得功能性奶粉(10mg/100g)。
实施例7隐孔菌多糖组成分析采用水解、还原、乙酰化法对实施例1制得隐孔菌多糖(CFSP1)，实施例2制得隐孔菌多糖(CFSP2)，实施例3制得隐孔菌多糖(CFSP3)进行组成糖分析，结果见表1表1隐孔菌多糖的组成糖
表1表明本发明制得的隐孔菌多糖的组成糖有6种，即岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，但含量大于10％的主要组成糖只有4种即甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，其中甘露糖含量最高。
对本发明所得的隐孔菌多糖部分甲基化，采用GC-MS分析部分甲基化产物，结果表明CFSP1、CFSP2、CFSP3的主链均由甘露糖、半乳糖、木糖构成，甘露糖和半乳糖主要连接方式为1→6，在2位上存在分支点，岩藻糖为1→3连接，木糖为1→4和1→3连接不存在分支点。多糖的末端主要为甘露糖和半乳糖，连接方式为1→。
需要说明的是，本测试结果是我们采用的方法只是测定多糖结构的方法之一，对于有这方面技术的人来说完全可以采用其它方法对隐孔菌多糖进行结构分析。由于分析的人员不同，采用的分析方法不同，仪器的灵敏度不同，得出的结果可能会有所不同，比如CFSP2中阿拉伯糖含量较低，CFSP3中测不出阿拉伯糖，组成糖和甲基化结果定量的结果不同等，这对于含量较低的组分相对影响较大。
实施例8隐孔菌多糖对支气管肺灌流液中炎症细胞的抑制作用1、实验名称隐孔菌多糖对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中的炎症细胞的作用。
2、实验目的评价隐孔菌多糖对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中的炎症细胞的作用。
3、材料3.1受试物实施例1、2、3所得隐孔菌多糖(CFSP1、CFSP2、CFSP3)及隐孔菌菌粉(CFS)3.2albumin，egg(V grade)，美国Sigma chemical Co.
3.3地塞米松磷酸钠，高邮制药厂3.4乌拉坦(Urethane)，中国医药公司上海化学试剂公司3.5PARI MASTER压缩吸入机(Type084G6305)，Made in Germany3.6SD大鼠，♀，清洁级，购于浙江大学医学院实验动物中心，合格证号浙实验动物实施条件准字22-96010184、方法1)分组SD大鼠共60只，分6组，见表2。
2)致敏将albumin溶于10％氢氧化铝凝胶中，配成2％卵白蛋白凝胶溶液。每只大鼠四足掌皮下注射，每点0.1ml；10天后再重复致敏一次。
3)给药从致敏第10天开始给药。受试物CFS生理盐水溶液0.5g/kg灌胃(ig)，CFSP1、CFSP2、CFSP3生理盐水溶液10mg/kg灌胃(ig)(给药剂量按照生理盐水溶液中隐孔菌多糖质量计算)，地塞米松(DXM)0.5mg/kg腹腔注射(ip)，以上受试物均给药10天。
4)抗原攻击致敏第18天，给药后1小时将致敏大鼠置于4L玻璃钟罩内，用PARI MASTER压缩吸入机气雾1.0％卵蛋白30min，次日重复攻击一次。将大鼠放回鼠笼再养24h后供实验用。
5)支气管肺泡灌流支气管肺泡灌流按文献方法，乌拉坦1g/kg ip大鼠，麻醉后切开颈部皮肤，分离出气管，切开气管，插入气管插管，用含肝素的Hanks溶液10ml，分2次，每次5ml，从气管插管注入气道，每次来回冲洗3回，冲洗液收集于试管内，回收率约70-80％(7-8ml)。
6)白细胞计数和分类计数1％冰醋酸1∶1稀释灌流液，用计数板在显微镜下计总数。将灌流液涂于玻片上，干后用Wright-Giemsa染色液染色，然后在油镜下分类计数。
5、结果模型组经1.0％卵蛋白2次攻击后，嗜酸性粒细胞明显增多、淋巴单核细胞百分率明显降低。表明致敏大鼠抗原攻击有非常明显的过敏性炎症反应过程。CFS和从中分离的CFSP1、CFSP2、CFSP3能明显抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺泡灌流液中嗜酸性粒细胞升高，其效果相当，证明CFSP1、CFSP2、CFSP3是CFS中主要的药效成分。具体结果见表2。
表2隐孔菌菌粉和隐孔菌多糖对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的抑制作用(x±SD)统计方法Mann-Whitney Rank Sum Test或T-test，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例9隐孔菌多糖对Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症的作用1、实验名称隐孔菌多糖对Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症的作用。
2、实验目的评价隐孔菌多糖对Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症的抑制作用。
3、材料3.1动物ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2克。购于中国科学院上海药物所，合格证号医动字第220010014。
3.2药品与试剂受试样品实施例1、2、3所得隐孔菌多糖(CFSP1、CFSP2、CFSP3)用无菌生理盐水溶解后，储存于4℃冰箱备用；地塞米松磷酸钠注射液(DXM)5mg/mL，湖北天药药业股份有限公司，批号20030605；Sephadex G 200Pharmacia进口分装 批号79-09-19；肝素华美生物工程公司，批号0203；羟丙基甲基纤维素上虞海申惠赠；小牛血清杭州四季青公司出品，批号20041008。
3.3主要仪器光学显微镜日本Olympus公司C011型928388Eppendorf高速冷冻离心机德国Eppendorf公司。
电子天平上海天平仪器厂FA1104型3.4试剂配制Sephadex G 200用1％羟丙基甲基纤维素溶液将Sephadex G 200配制为0.1mg/ml的混悬液，并高压灭菌。
灌洗液1％小牛血清D-Hanks缓冲液(含5IU/ml肝素)，临用前配制。
4、实验方法4.1Sephadex G 200诱导小鼠腹腔炎症细胞聚集试验4.1.1分组本实验共分5组，即模型组；CFSP1组(10mg/kg，ig)；CFSP2组(10mg/kg，ig)；CFSP3组(10mg/kg，ig)；CFSP1静脉注射组(10mg/kg，iv)；DXM阳性对照组(0.5mg/kg，ig)，所述用量按生理盐水溶液中隐孔菌多糖的量计算。
4.1.2给药方法致炎前对各组小鼠每天给药1次，连续3天。致炎后每天给药1次，连续2天。模型组生理盐水0.3mL/10g灌胃，每天1次，连续5天；各给药组依据分组分别进行给药。
4.1.3动物致炎第4次给药前致炎。模型组、给药组及阳性对照药组，均用Sephadex G200(0.1mg/mL)腹腔注射，每只小鼠2mg/kg。
4.1.4腹腔灌洗于腹腔致炎48h后采用颈椎脱臼法处死小鼠。每只小鼠腹腔注射灌洗液5mL，轻揉片刻后吸出腹腔灌洗液。
4.1.5白细胞计数将腹腔灌洗液摇匀后取出50μL，用白细胞稀释液稀释4倍，取少量滴于细胞计数板上，在显微镜下计数白细胞总数。
4.1.6白细胞分类计数将腹腔灌洗液低温2000rpm离心10min后，弃去上清液，用移液器打匀后涂片。待涂片在室温下干后，Wright染色6～8min，姬姆萨复染1分钟。用自来水小心将染料冲洗干净，在光学显微镜40倍镜下进行细胞分类计数。
5、结果CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起的小鼠腹腔炎症细胞聚集，与模型组相比，P＜0.05～0.001，见图1。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)和静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了腹腔内多形核白细胞的聚集，P＜0.05～0.01，结果见图2。CFSP1、CFSP2、CFSP3灌胃(10mg/kg)以及静脉注射(10mg/kg)都显著抑制了多核粒细胞和淋巴单核细胞的聚集，与模型组相比，P＜0.05～0.001，见图3。
权利要求
1.一种隐孔菌多糖，其特征在于所述隐孔菌多糖由含隐孔菌或隐孔菌发酵物的原料提取制得，分子量范围为2000～200000，主要由甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖四种单糖组成，主链由1→6连接的甘露糖，1→6半乳糖，1→3连接的岩藻糖和1→4、1→3连接的木糖构成。
2.如权利要求1所述的隐孔菌多糖，其特征在于所述的隐孔菌多糖由如下方法制备得到将含隐孔菌多糖的原料加水提取，水提液浓缩后加入聚乙二醇混匀，静置沉淀，取沉淀物用乙醇洗涤，沉淀物水溶，离心，除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥得隐孔菌多糖。
3.如权利要求2所述的隐孔菌多糖，其特征在于所述的含隐孔菌多糖的原料为下列之一或下列两种或两种以上任意形式的组合①天然隐孔菌；②隐孔菌液体培养液；③隐孔菌菌丝体；④隐孔菌固体培养物；⑤隐孔菌菌粉。
4.制备如权利要求1～3之一所述的隐孔菌多糖的方法，其特征在于所述的方法如下将含隐孔菌多糖的原料加水提取，水提液浓缩后加入聚乙二醇混匀，静置沉淀，取沉淀物用乙醇洗涤，沉淀物水溶，离心，去除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥得隐孔菌多糖。
5.如权利要求4所述的隐孔菌多糖的制备方法，其特征在于所述的方法如下将含隐孔菌多糖的原料加入5～10质量倍的水，70～90℃下提取1～4小时，水提液离心得上清液浓缩至比重为1.0～1.3，得浓缩液，每100mL浓缩液加入聚乙二醇5～50g，充分搅拌后静置过夜沉淀，离心得沉淀物用95％乙醇洗涤，沉淀物水溶、离心后去除蛋白质，再离心、膜分离截留2000～200000分子量范围，浓缩后干燥即得所述的隐孔菌多糖。
6.如权利要求5所述的隐孔菌多糖的制备方法，其特征在于所述的含隐孔菌多糖的原料为下列之一或下列两种或两种以上任意形式的组合①天然隐孔菌；②隐孔菌液体培养液；③隐孔菌菌丝体；④隐孔菌固体培养物；⑤隐孔菌菌粉。
7.如权利要求5所述的隐孔菌多糖的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇为PEG1000～20000。
8.如权利要求5所述的隐孔菌多糖的制备方法，其特征在于所述的方法如下隐孔菌菌粉加入5倍质量的水，80℃提取2小时，提取液取上清液；沉淀加适量水充分搅拌提取，提取液离心得上清液，两次上清液合并，减压浓缩至体积缩小一倍得浓缩液，不断搅拌下，每100mL浓缩液加入15克PEG6000，搅拌使充分溶解，室温放置过夜，使沉淀完全，离心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本无色，得沉淀溶解于适量水中，离心除去不溶物，上清加蛋白内切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室温，离心除去不溶物，上清用截流分子量50万的超滤膜过滤，滤液用截流分子量2万的超滤膜浓缩，浓缩液冻干即得所述的隐孔菌多糖。
9.如权利要求5所述的隐孔菌多糖的制备方法，其特征在于所述的方法如下天然隐孔菌粉碎后加入2.5倍质量的水，80℃提取2小时，提取液取上清液；沉淀加适量水充分搅拌提取，提取液离心得上清液，两次上清液合并，减压浓缩至体积缩小一倍得浓缩液，不断搅拌下，每100mL浓缩液加入25克PEG20000，搅拌使充分溶解，室温放置过夜，使沉淀完全，离心得沉淀用95％乙醇回流提取至提取液基本无色，得沉淀溶解于适量水中，离心除去不溶物，上清加蛋白内切酶，水解后把水解液煮沸，放冷至室温，离心除去不溶物，上清用截流分子量5000的透析袋流水透析48小时，透析内液用0.45微米的膜过滤后60℃蒸干即得所述得隐孔菌多糖。
10.如权利要求1～3之一所述的隐孔菌多糖在制备治疗过敏性鼻炎药物中的应用。
11.如权利要求1～3之一所述的隐孔菌多糖在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用。
12.如权利要求1～3之一所述的隐孔菌多糖在制备治疗成人型呼吸窘迫综合征药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种隐孔菌多糖及其制备方法，以及这种隐孔菌多糖在制备治疗过敏性鼻炎药物与过敏性哮喘药物中的应用及在制备治疗成人型呼吸窘迫综合征药物中的应用。本发明所述的隐孔菌多糖及其制备与应用的有益效果主要体现在(1)本发明所述隐孔菌多糖药用成分更明确，并能非常显著地抑制致敏大鼠抗原攻击后肺部嗜酸性炎症的作用，可以开发成新药或功能性食品或保健品用于过敏性鼻炎和过敏性哮喘，具有广阔应用前景；(2)所述隐孔菌多糖制备方法用PEG沉淀多糖所得产品多糖含量要远高于用乙醇沉淀所得多糖含量，且用PEG的量仅为乙醇用量的二十分之一左右，得率高，含量高，成本低，且操作简便。
文档编号A61K31/715GK1919875SQ20051006046
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月23日 优先权日2005年8月23日
发明者柯传奎, 杨勇杰, 谢强敏, 陈黎, 欧阳小军, 柴黎燕 申请人:杭州赐富生物技术有限公司, 柯传奎, 杨勇杰