一种治疗脑卒中的药用组合物及其应用的制作方法

本发明属于药物领域，具体涉及一种用于治疗脑卒中的依达拉奉和ZL006乙酯药用组合物及其用途。

背景技术：

缺血性脑卒中严重危害人类健康和生命安全，并且是导致长期残疾的主要原因，如何改善卒中预后是临床治疗的重要目标。缺血性脑卒中的缺血-再灌注损伤是卒中患者神经损伤加重的重要原因，神经保护剂能够提高血供恢复后神经元的存活率、改善神经功能，减轻卒中患者的缺血-再灌注损伤，得到了广泛重视。针对脑卒中病理生理机制的环节，研究开发了众多神经保护剂，但是进展有限。目前唯一临床有效的自由基清除剂依达拉奉疗效仍然不能令人满意。

缺血性脑卒中病理生理机制主要包括以神经细胞死亡、炎症发生、血脑屏障破坏等组织损伤为特征的急性期和以神经血管恢复为特征的后期。以往研究显示仅仅针对脑卒中病理生理机制中单一环节的药物，即使在动物模型中可以有较好的效应，也无法在临床实验中取得相应的疗效。目前认为，只有作用于脑卒中发生发展的多个病理环节并发挥强大神经保护作用的药物才有可能成为有效的脑卒中治疗新药(Stroke，2009；40(8):2899-905)。

在再灌注期间，血氧部分或全部恢复，氧气作为几种重要反应的底物，生成很多氧自由基，而后者在铁蛋白存在的条件下转变为羟自由基，攻击膜结构和DNA，最终破坏细胞的结构和功能；依达拉奉为强效自由基清除剂，依达拉奉在体内以阴离子形式存在、并可转移一个电子给自由基，清除自由基，并且打断脂质过氧化反应链进而保护神经细胞(中国临床药理学与治疗学，2011,341-348)。但是，依达拉奉毒副作用较大，据日本临床病例569例观察，26例(4.57％)出现不良反应。主要表现为肝功能异常16次(2.81％)，皮疹4次(0.70％)。569例中临床检测值异常变化的有122例(21.4％)，主要是AST上升7.71％(43/558)，ALT上升8.23％(46/559)等肝功能检测值异常。

脑缺血后兴奋性递质谷氨酸大量释放，激活神经元突触后膜上的N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)，引起NMDAR突触后致密蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD95)/神经元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)三元复合物的形成,进一步激活nNOS，产生大量一氧化氮(nitric oxide,NO)，NO本身具有较强的氧化性，释放过多或清除功能不足时，会直接损伤周围细胞表面脂质和内部结构。另一方面，脑缺血再灌注过程中生成了大量的氧阴离子自由基(O₂^-.)，和NO反应生成超氧亚硝酸阴离子自由基(ONOO^-.)，后者作为稳定的强氧化物，将对细胞造成更为严重的损伤(Cell.Mol.Life Sci.,2004,61,657-668)。NMDAR抑制剂能够减少脑缺血后NO的释放，具有一定的神经保护作用，但是不良反应较大，临床效果不确切。小分子化合物ZL006能够特异性阻断PSD-95蛋白与nNOS的偶联，减少NMDAR/PSD95/nNOS三元复合物的形成，可以在不影响NMDA受体的生理功能、不干扰nNOS的活性及其他亚型NOS功能的同时，减少NO的释放，减轻缺血性卒中后神经细胞的凋亡和损伤(Nature Medicine 2010:1439-1443)。由于ZL006难以通过血脑屏障，脑组织分布低，我们的研究发现，高剂量ZL006(10mg/kg)不能获得比正常剂量ZL006(2mg/kg)更好的治疗效果。ZL006乙酯能够改善ZL006的脑组织分布，具有良好的神经保护作用(Bioorg Med Chem Lett.2016:2152-2155)。但是，我们发现，高剂量ZL006乙酯(10mg/kg)同样不能获得比正常剂量ZL006乙酯(1mg/kg)更好的治疗效果。

在超过安全有效剂量范围后，进一步提高依达拉奉或者ZL006乙酯的剂量难以获得更好的治疗作用，同时会引起毒副作用的增加。我们的研究发现，将依达拉奉和ZL006乙酯以适当的比例联合给药，可以获得比单用依达拉奉或者ZL006乙酯更好的治疗效果，也可以在联合给药依达拉奉较低的剂量下获得比单用较高剂量依达拉奉更好的治疗效果。特别的,依达拉奉对缺血性脑卒中恢复期的神经功能没有改善,而依达拉奉和ZL006乙酯药用组合物还能够改善缺血性脑卒中恢复期的神经功能。因此，依达拉奉与ZL006乙酯以恰当的方式形成的组合物，将能够同时产生自由基清除和阻断nNOS-PSD-95解耦，通过两个靶点发挥协同作用，从而发挥良好的神经保护作用，还能够改善缺血性脑卒中恢复期的神经功能。是本发明最重要的创新之处。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种治疗脑卒中的药用组合物及其应用，该药物组合物的成分之间具备协同增效的作用，通过ZL006乙酯显著提升了依达拉奉的疗效，还能够改善缺血性脑卒中恢复期的神经功能。

技术方案：一种治疗脑卒中的药用组合物，包括依达拉奉和ZL006乙酯。

优选的，依达拉奉和ZL006乙酯的质量比为(5-1):1。

上述药用组合物在制备治疗脑卒中药物中的应用

本发明中的药物组合物施用方式优选以注射形式给药，包括但不限于注射剂、冻干剂等。

有益效果：依达拉奉能够清除自由基，并且打断脂质过氧化反应链进而保护神经细胞，ZL006乙酯可以解开PSD95-nNOS耦联从而避免过多NO生成的物质，依达拉奉和ZL006乙酯以适当的比例配合使用时具有增强或协同作用的效果，可以提高使用效果。将依达拉奉和ZL006乙酯以适当的比例联合给药，可以获得比单用依达拉奉或者ZL006乙酯更好的治疗效果，也可以在联合给药依达拉奉较低的剂量下获得比单用较高剂量依达拉奉更好的治疗效果。在获得同样治疗效果的前提下，由于依达拉奉给药浓度的减少，降低了不良反应发生的风险，还能够改善缺血性脑卒中恢复期的神经功能。

附图说明

图1为依达拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用示意图(1：溶剂组(1％亚硫酸氢钠溶液)，2：ZL006乙酯组，3：依达拉奉组，4：依达拉奉和ZL006乙酯联合给药组)A：各剂量组脑梗死面积与溶剂组的比较。B：各组神经缺陷症状评分与溶剂组的比较。

图2为依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用示意图(1：溶剂组(1％亚硫酸氢钠溶液)，2：ZL006乙酯组，3：依达拉奉组，4：依达拉奉和ZL006乙酯联合给药组)A：各剂量组脑梗死面积与溶剂组的比较。B：各组神经缺陷症状评分与溶剂组的比较。

图3为依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血恢复期的保护作用示意图(1：溶剂组(1％亚硫酸氢钠溶液)，2：ZL006乙酯组，3：依达拉奉组，4：依达拉奉和ZL006乙酯联合给药组)。各组神经缺陷症状评分与溶剂组的比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。

实施例1

局灶性脑缺血再灌注模型的制备

采用大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型诱导脑缺血损伤。大鼠经2％水合氯醛(0.2mL/10g，i.p.)麻醉后，将动物仰卧固定于手术台上，沿颈正中切开皮肤，钝性分离颈部肌肉组织，暴露右侧颈总动脉(CCA)并小心游离；轻轻剥离伴行的迷走神经，结扎并剪断向内及浅表走向的颈外动脉分支(ECA)；循颈内动脉(ICA)向前，在颅底附近有向外侧的分支动脉—翼腭动脉，将其分离结扎。CCA近心端以手术线结扎；结扎线的远端用眼科剪剪开小口，将商业化用于手术用MCAO模型制备的尼龙线(4/0号)沿该小口处插入，插入约20mm感觉有轻微阻力时为止，提示线栓前端已经达到大脑前动脉。至此，大脑中动脉(MCA)的血液供应包括颈动脉和大脑韦氏环前交通支来源的血供均已阻断。根据标记判断插入线拴的深度。线拴的血管外部分结扎固定，防止线栓的滑脱。右侧脑缺血120分钟后，小心拔除线栓，结扎断端，实现缺血后的再灌注。缝合皮肤，回笼精心喂养。手术过程中保持动物体温恒定在37±0.5℃。

局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经缺陷症状评价

采用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价。采用单盲法评价脑缺血后大鼠的神经缺陷症状，即由试验设计者将动物按组标记，对神经缺陷症状进行评分的试验者不知道动物的分组情况，评分结束后，评分者将各种标记的评分结果呈交设计者，由设计者揭盲，获得各试验组每只动物的评分。

脑梗死面积测定

动物用10％的水合氯醛3.5mL/kg麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-80℃放置7min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切片，将脑片置于用0.2mol/L pH 7.4～7.8PBS新鲜配制的20g/L TTC染液中水浴(37℃90min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排成一排，吸干表面残留水迹，拍照。用图像分析软件对照片进行统计，圈定右侧缺血面积(白色区域)和右侧总面积，用如下公式计算脑梗死面积的百分比。

实验1、依达拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

大鼠MCAO 120分钟，再灌注后1小时尾静脉注射依达拉奉(5mg/kg)、ZL006乙酯(1mg/kg)、依达拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)、以及等体积的溶剂(1％亚硫酸氢钠溶液)，注射药物的体积为0.1mL/100g体重，于脑缺血后48小时评价神经缺陷症状，而后处死动物，取脑，TTC染色，测定染色后脑片的梗死面积。结果如图1所示：与溶剂对照组相比，各组显著降低脑梗死面积，显著减轻神经缺陷症状。联合给药组比单独给药组显示了更好的神经保护作用。

实验2、依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

采用实验1的方法，分别测定依达拉奉(1mg/kg)、依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)的混合液对大鼠MCAO神经保护作用，结果如图2所示：与溶剂对照组相比，各组显著降低脑梗死面积，显著减轻神经缺陷症状。联合给药组比单独给药组显示了更好的神经保护作用。

实验3、依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯联合给药对于大鼠急性局灶性脑缺血恢复期的保护作用

大鼠MCAO 120分钟，再灌注后4天尾静脉注射依达拉奉(1mg/kg)、ZL006乙酯(1mg/kg)、依达拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)、以及等体积的溶剂(1％亚硫酸氢钠溶液)，注射药物的体积为0.1mL/100g体重，每天给药1次，于脑缺血后11天评价神经缺陷症状。结果如图3所示：与溶剂对照组相比，各组显著减轻神经缺陷症状。联合给药组比单独给药组显示了更好的神经保护作用。

以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。