本发明涉及天然产物应用领域，且特别涉及一种牡丹多糖及其制备方法和应用。
背景技术：
自由基，化学上也称为“游离基”，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。自由基反应在燃烧、气体化学、聚合反应、等离子体化学、生物化学和其他各种化学学科中扮演很重要的角色。外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。
体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏作用，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。众多医学研究及临床试验证明：人体细胞电子被抢夺是万病之源，自由基ROS是一种缺乏电子的物质(不饱和电子物质)，进入人体后到处争夺电子，如果夺去细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，形成畸变的分子而致癌。该畸变分子由于自己缺少电子，又要去夺取邻近分子的电子，又使邻近分子也发生畸变而致癌。这样，恶性循环就会形成大量畸变的蛋白分子，基因突变形成大量癌细胞，最后出现癌症。而当自由基或畸变分子抢夺了基因的电子时，人就会直接得癌症。人体得到负离子后，由于负离子带负电有多余的电子，可提供大量电子，而阻断恶性循环，癌细胞就可防止或被抑制。目前用于清除自由基的药品种类较少且其中有些还具有副作用，因而从天然植物中寻找高效、副作用小的自由基抑制剂为目前国内外研究的热点。
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)，又名鼠姑、木芍药、洛阳花和富贵花，属于小灌木芍药科植物，主要生长在我国长江流域及黄河流域等地区，其富含多种营养成分自古以来皆用其根皮入药，名曰“丹皮”。《新华本草纲要》中记载牡丹性微寒，味苦辛，无毒，入心、肝、肾经。具有清肝火、活血散瘀的功能。近来年，研究发现牡丹可用于治疗斑疹吐血、臃肿疮毒、阴虚发势和无汗骨蒸等疾病。目前国内外学者对牡丹的化学成分及其应用研究取得了一定进展，但还需要系统深入研究多糖类、黄酮类和多酚类物质的结构和活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种牡丹多糖的制备方法，此制备方法操作简单，易于实现，制得的多糖物质含量较多且对自由基的清除作用较强。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备而得的牡丹多糖，该多糖具有很好的自由基清除作用。其原料为天然产物，毒副作用小，可广泛应用于各种自由基清除剂中。
本发明的第三目的在于提供一种牡丹多糖的应用，即将牡丹多糖作为活性成分应用于自由基清除剂中。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种牡丹多糖的制备方法，其包括以下步骤：
粉碎牡丹原料至其粒径为400-600μm，牡丹原料选自牡丹叶片或牡丹种皮；
然后对粉碎后的牡丹原料进行提取分离并收集分离后的上清液得粗提物，提取分离按以下方式进行：按料液比5-20g：80-400mL将提取剂与粉碎后的牡丹原料混合，提取30-100min，过滤收集上清液；提取剂为亲水性有机溶液；
然后将粗提物与蛋白质变性剂混合，于2-8℃的条件下静置12-48h，离心，收集离心后的上清液得粗多糖溶液；
然后向粗多糖溶液中加入无水乙醇溶液得待浓缩液，浓缩后得牡丹多糖。
本发明还提出一种由上述制备方法制备所得的多糖物质。
本发明还提出了一种牡丹多糖在制备自由基清除剂中的应用。
本发明实施例的一种牡丹多糖及其制备方法和应用的有益效果是：通过对牡丹进行粉碎，增加了原料与提取剂之间的接触面积，提高浸出速度。以亲水性有机溶剂为提取剂，既能保证浸出速度快、浸出物的纯度高、杂质少，而且还能降低成本。5-20g：80-400mL的料液比可使牡丹中的活性成分提取效果较佳；提取时间选为30-100min，避免因提取时间过短造成有效物质溶出率低，提取时间过长又会使得植物细胞中的油脂、鞣质等杂质过多的溶出，增大分离纯化的难度等缺陷。将粗提物与蛋白质变性剂混合可使粗提物中的蛋白质变性，2-8℃条件下静置可使蛋白质充分变性沉淀，使牡丹多糖的分离效果和提取率达到最佳。该方法操作简单，易于实现，制备出的牡丹多糖具有很好的自由基清除作用。由于该发明的原料为天然产物，毒副作用小，故由其制备出的多糖物质可广泛应用于各种自由基清除剂中。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的牡丹多糖及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明实施例提供的牡丹多糖的制备方法，以我国特有的牡丹为原料，其花瓣大而香、颜色鲜艳，有“国色天香”的誉称，代表着华贵与端庄。具体的，本发明实施例中的牡丹例如可选取铜陵凤凰山的“凤丹”叶片或种皮中的一种为原料，也可同时将叶片和种皮共同作为原料。制备过程中，可先对原料进行粉碎，以增加原料与提取剂之间的接触面积，提高浸出速度。其中，叶片和种皮的粉碎粒度例如可以为400-600μm，优选的，叶片和种皮的粉碎粒度例如还可以为420-580μm，该粒度范围内牡丹的叶片或种皮中的有效成分溶出率较大。原料优选采自盛花期的新鲜牡丹，此时期的牡丹中的有效成分含量最高，有利于提高后续提取物中的有效成分的含量。
作为优选的，在粉碎步骤之前，还可以对牡丹进行除杂、清洗和干燥等工序。其中除杂和清洗可避免其它杂质对制备效果的干扰，干燥可部分破坏原料的细胞膜和细胞壁，利于提取。其中，干燥温度例如可以选择为20-45℃，优选为35-37℃。在此优选的温度范围内，原料中的活性成分可最大程度的保留并不被高温破坏。
较佳的，本发明实施例采用浸提法，以亲水性有机溶剂作为提取剂对粉碎后的原料进行提取。利用相似相溶原则，该亲水性有机溶剂例如可优选为乙醇的水溶液，既能保证浸出速度快、浸出物的纯度高、杂质少，而且成本低。当选用无水乙醇-水溶液作为提取剂时，无水乙醇的体积分数例如可以为70％-90％，优选为80％，此体积分数下无水乙醇溶液的极性适中，使得牡丹中的绝大部分有效成分易溶于该溶液中，提取较快且杂质较少。此外，还可选用甲醇-水溶液等。
将提取剂与粉碎后的牡丹原料以料液比例如为5-20g：80-400mL混合，得到待提物。作为优选的，料液比例如可以为10g：100mL，在此比例下，牡丹中的活性成分提取效果最佳。
进一步的，将待提物进行第一次提取。作为优选的，本发明实施例中的第一次提取采用水浴浸提，浸提的温度例如可以为60-85℃，浸提的时间优选为30-100min，得第一提取物。因提取时间过短或提取温度过低会造成有效物质溶出率低，提取时间过长或提取温度过高又会使得植物细胞中的油脂、鞣质等杂质过多的溶出，增大分离纯化的难度，故提取时间优选为40min，提取温度优选为80℃。
此外，提取方式还可以采用微波提取、超声波提取、超临界流体提取等。
将第一提取物进行第一次过滤，例如可以为离心过滤，收集分离后的上清液，得第一分离物。该离心过滤所用的离心设备的转速例如可设置为3000-5000r/min，离心过滤的时间例如可以为10-35min。作为优选的，本发明实施例的第一提取物于4000r/min的条件下离心20min，此条件下，离心效果最佳。
为了降低原料中多糖的损失率，还可将第一次过滤后所剩的沉淀进行第二次提取，例如可将第一次过滤后所得的沉淀与上述提取剂再次按料液比5-20g：80-400mL混合，于60-85℃条件下第二次水浴浸提30-100min，得到第二提取物并于3000-5000r/min的离心条件下第二次过滤10-35min，收集上清液得第二分离物。其中，第二次过滤也优选于4000r/min的条件下离心20min。此外，根据实际操作情况，还可在第二次提取的基础上继续进行多次提取分离。
收集分离后所得的上清液作为粗提物，将该粗提物与蛋白质变性剂混合，其中，蛋白质变性剂例如可选用三氯乙酸溶液，粗提物与三氯乙酸溶液例如可以按投料体积比为1mL:6-20mL混合，优选为1mL:12mL。其中，三氯乙酸溶液中的三氯乙酸的质量百分数例如可以为6-15％，优选为10％，该条件下三氯乙酸更易使蛋白质变性并形成不溶性物质。此外，本发明实施例中的蛋白质变性剂还以选用尿素、盐酸胍等物质。
将混合后的粗提物和蛋白质变性剂于2-8℃的条件下静置12-48h，优选于4℃的冰箱中冷藏静置24h后离心以去除蛋白质部分，收集上清液得粗多糖溶液。其中，本发明实施例所采用的离心时间例如可以为15-30min，离心转速例如可以为3000-5000r/min。优选的，该离心时间为10min且离心转速为4000r/min，此离心条件下能使蛋白质成分完全沉淀。
去除离心后的蛋白质沉淀，并于粗多糖溶液中加入无水乙醇水溶液得待浓缩液，优选的，该待浓缩液中所含的无水乙醇溶液的体积分数大于等于80％，以利于多糖物质的溶解和浓缩。
较佳的，例如可将上述的待浓缩液浓缩至其含水率小于或等于10％，得到牡丹多糖。作为优选的，本发明实施例中例如可以将待浓缩液于45-55℃的水浴、转速为30-50转/min、以及真空度为0.07-0.09MPa的条件下旋转蒸发，除去有机相中的乙醇，得到浸膏状的牡丹多糖，该条件下进行的减压浓缩，有利于在回收溶剂时避免牡丹中活性成分的结构受到破坏。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
将新鲜凤丹的叶片和种皮分别粉碎至粒度为400μm和420μm，以甲醇-水溶液为提取剂，其中甲醇的体积百分数为80％。按料液比5g：80mL将提取剂与粉碎后的叶片和种皮混合，得到待提物。于60℃的条件下水浴浸提100min，得到第一提取物。将该第一提取物于3000r/min的条件离心35min，收集离心后的上清液得第一分离物。将第一分离物与质量百分数为6％的三氯乙酸溶液以投料体积比为1mL:6mL混合，于2℃的冰箱中冷藏静置48h后，于3000r/min的离心条件下离心30min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为80％，将该待浓缩液于45℃的水浴、50转/min的转速以及0.07MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为10％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.085ug的牡丹多糖。
实施例2
将新鲜凤丹的叶片和种皮进行除杂、清洗，于20℃下烘干并分别粉碎至粒度为600μm和580μm，以无水乙醇-水溶液为提取剂，其中无水乙醇的体积百分数为70％。按料液比5g：400mL将提取剂与粉碎后的叶片混合，得到待提物。于85℃的条件下水浴浸提30min，得到第一提取物。将该第一提取物于5000r/min的条件离心10min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与无水乙醇-水溶液按料液比5g：400mL混合，并于85℃的条件下第二次水浴浸提30min，得到第二提取物。将该第二提取物于5000r/min的条件离心10min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:20mL与质量百分数为15％的三氯乙酸溶液混合，于8℃的冰箱中冷藏静置12h后，于5000r/min的离心条件下离心15min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于55℃的水浴、30转/min的转速以及0.08MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为8％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.056ug的牡丹多糖。
实施例3
将新鲜凤丹的叶片和种皮进行除杂、清洗，于45℃下烘干并粉碎至粒度为420μm和600μm，以无水乙醇-水溶液为提取剂，其中无水乙醇的体积百分数为90％。按料液比20g：80mL将提取剂与粉碎后种皮混合，得到待提物。于72℃的条件下水浴浸提65min，得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心22.5min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与无水乙醇-水溶液按料液比20g：80mL混合，并于72℃的条件下第二次水浴浸提65min，得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心22.5min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:13mL与质量百分数为10.5％的三氯乙酸溶液混合，于5℃的冰箱中冷藏静置30h后，于4000r/min的离心条件下离心22.5min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为85％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为6％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.025ug的牡丹多糖。
实施例4
将新鲜凤丹的叶片和种皮进行除杂、清洗，于37℃下烘干并粉碎至粒度为580μm和400μm，以无水乙醇-水溶液为提取剂，其中无水乙醇的体积百分数为80％。按料液比20g：400mL将提取剂与粉碎后的叶片和种皮混合，得到待提物。于80℃的条件下水浴浸提40min，得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与无水乙醇-水溶液按料液比20g：400mL混合，并于80℃的条件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与质量百分数为10％的三氯乙酸溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为95％，将该待浓缩液于55℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为4％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.078ug的牡丹多糖。
实施例5
将新鲜凤丹进行除杂、清洗，于35℃下烘干并将其叶片和种皮均粉碎至粒度为500μm，以无水乙醇-水溶液为提取剂，其中无水乙醇的体积百分数为80％。按料液比10g：100mL将提取剂与粉碎后的叶片和种皮混合，得到待提物。于80℃的条件下水浴浸提40min，得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与无水乙醇-水溶液按料液比10g：100mL混合，并于80℃的条件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与质量百分数为10％的三氯乙酸溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为2％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.091ug的牡丹多糖。
实施例6
将新鲜凤丹进行除杂、清洗，于32.5℃下烘干并将其叶片和种皮均粉碎至粒度为500μm，以甲醇-水溶液为提取剂，其中甲醇的体积百分数为80％。按料液比10g：100mL将提取剂与粉碎后的叶片和种皮混合，得到待提物。于80℃的条件下水浴浸提40min，得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与甲醇-水溶液按料液比10g：100mL混合，并于80℃的条件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与尿素溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为9％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.083ug的牡丹多糖。
实施例7
将新鲜牡丹进行除杂、清洗，于36℃下烘干并将其叶片粉碎至粒度为500μm，以甲醇-水溶液为提取剂，其中甲醇的体积百分数为80％。按料液比10g：100mL将提取剂与粉碎后的叶片混合，得到待提物。于80℃的条件下水浴浸提40min，得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀与甲醇-水溶液按料液比5g：80mL混合，并于60℃的条件下第二次水浴浸提100min，得到第二提取物。将该第二提取物于3000r/min的条件离心35min，收集此次离心后的上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与盐酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为7％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.053ug的牡丹多糖。
实施例8
将新鲜牡丹进行除杂、清洗，于36℃下烘干并将其种皮粉碎至粒度为500μm，采用微波提取得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀再次微波提取后得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与盐酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为5％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.033ug的牡丹多糖。
实施例9
将新鲜牡丹进行除杂、清洗，于36℃下烘干并将其叶片和种皮均粉碎至粒度为500μm，采用超声波提取得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀再次超声波提取后得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第一分离物和第二分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与盐酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为3％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.077ug的牡丹多糖。
实施例10
将新鲜牡丹进行除杂、清洗，于36℃下烘干并将其叶片和种皮均粉碎至粒度为500μm，采用超临界流体提取得到第一提取物。将该第一提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第一分离物。将离心后所剩的沉淀再次超临界流体提取后得到第二提取物。将该第二提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第二分离物。将第二提取物离心后所剩的沉淀进行第三次超临界流体提取后得到第三提取物。将该第三提取物于4000r/min的条件离心20min，收集上清液得第三分离物，将第一分离物、第二分离物和第三分离物合并，并以投料体积比为1mL:12mL与盐酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏静置24h后，于4000r/min的离心条件下离心10min，去除蛋白质部分，收集此次离心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入无水乙醇得待浓缩液并使待浓缩液中的无水乙醇溶液的体积分数为90％，将该待浓缩液于50℃的水浴、40转/min的转速以及0.09MPa的真空度条件下旋转蒸发至其含水率为1％，得到牡丹多糖。本实施例中1ul粗多糖溶液中含有0.081ug的牡丹多糖。
试验例1
采用如下的自由基清除作用试验方法，对实施例中所得的牡丹多糖物质进行清除率测试。
测试方法：重复以上实施例1-10以制得足够多的牡丹叶片多糖、牡丹种皮多糖以及牡丹叶片与种皮混合多糖作为试验组，以市售多糖作为对照组，分别配置成不同浓度的多糖溶液作为待测液，其浓度依次为0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.075ug/ul、0.1ug/ul和0.125ug/ul。
测定待测物对自由基清除作用的反应溶液包括：待测液、0.2M且pH为7.4的磷酸缓冲液、7.5mmol/LFeSO4、超纯水、5.0mmol/L邻二氮菲溶液和0.1％过氧化氢溶液。反应共需空白管、未损伤管、损伤管、样品空白管和加样管共计5个反应体系。其中，空白管中加入2mL浓度为0.2mol/L且pH为7.4的磷酸缓冲液和8mL超纯水；未损伤管加入2mL浓度为0.2mol/L且pH为7.4的磷酸缓冲液、2mL的7.5mmol/L的FeSO4、5.4mL的超纯水和1.6mL的邻二氮菲溶液；损伤管中加入2mL浓度为0.2mol/L且pH为7.4的磷酸缓冲液、1mL的7.5mmol/L的FeSO4、4.4mL的超纯水、1.6mL的邻二氮菲溶液和1mL的过氧化氢溶液；样品空白管中加入2mL浓度为0.2mol/L且pH为7.4的磷酸缓冲液、7mL超纯水和1mL各浓度的多糖待测溶液；加样管中加入2mL浓度为0.2mol/L且pH为7.4的磷酸缓冲液、1mL的7.5mmol/LFeSO4、3.4mL超纯水、1.6mL邻二氮菲溶液、1mL过氧化氢溶液和1mL各浓度的多糖待测溶液。把加入试剂后的各个试管在40℃的恒温水浴中放置1h，分别以样品空白管和空白管作为对照管置零，在536nm波长处测出损伤管、未损伤管和不同浓度牡丹多糖待测物以及市售多糖加样管的吸光度数值，计算牡丹多糖以及市售多糖对羟基自由基的清除率。计算公式如下：
羟基自由基清除率(％)＝[(A3-A2)/(A1-A2)]×100％。
其中：A1、A2分别为未损伤和损伤管的吸光度值；A3为不同浓度牡丹多糖以及市售多糖加样管的吸光度值。
测试结果如下：在实施例1-10中，实施例5所制备出的牡丹多糖对自由基清除作用最强，其原因在于该实施例以牡丹种皮和叶片共同作为原料，其制备过程中所采用的工艺条件均为最优值。此外，浓度分别为0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.075ug/ul、0.1ug/ul和0.125ug/ul时，牡丹叶片多糖、牡丹种皮多糖和牡丹叶片与种皮混合多糖的对应的羟基自由基清除率如表1所示：
表1不同浓度下牡丹多糖的羟基自由基清除率
由表1可看出，在同一浓度条件下，牡丹种皮多糖、牡丹叶片多糖以及牡丹叶片与种皮混合多糖对羟基自由基的清除作用依次增强；该三种多糖清除羟自由基的能力均随多糖浓度的增加而加强，且呈显著的正相关关系。另外，从测试结果还可以得出牡丹叶片多糖以及牡丹叶片与种皮混合多糖均显著高于市售多糖的自由基清除效果，故本发明实施例所制备出的牡丹多糖具有较强的自由基清除效果。
因此，利用牡丹多糖对自由基的清除作用，可以将牡丹多糖应用于制备自由基清除剂。并且作为优选，牡丹多糖可以采用上述的牡丹多糖制备方法制备而得。此外，该多糖物质来自天然植物，毒副作用小，还可将其用于各种保健品中，例如可清除自由基类的保健食品中。
综上所述，本发明实施例通过对牡丹进行粉碎，增加了原料与提取剂之间的接触面积，提高浸出速度。以亲水性有机溶剂为提取剂，既能保证浸出速度快、浸出物的纯度高、杂质少，而且还能降低成本。以5-20g：80-400mL作为料液比可使牡丹中的活性成分提取效果较佳；采用于60-85℃水浴浸提30-100min的方式，可避免因提取时间过短造成有效物质溶出率低，提取时间过长又会使得植物细胞中的油脂、鞣质等杂质过多的溶出，增大分离纯化的难度等缺陷。将粗提物与蛋白质变性剂中的三氯乙酸溶液混合可使粗提物中的蛋白质变性，2-8℃条件下静置能使蛋白质充分变性沉淀，使牡丹多糖的分离效果和提取率达到最佳。该方法操作简单，易于实现，制备出的牡丹多糖具有很好的自由基清除作用。由于该发明的原料为天然产物，毒副作用小，故由其制备出的多糖物质可广泛应用于各种自由基清除剂中。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。