一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
：醛酮还原酶(Aldo-ketoreductase，AKR)广泛存在于生物界，是一类依赖于NAD(P)H的分子量在34kDa-37kDa之间的单体还原酶蛋白。现报道的AKR超家族成员有16个亚家族共190多个成员，包括醛糖还原酶、酮还原酶、羟化类固醇脱氢酶、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、多元醇脱氢酶、二氢二醇脱氢酶等多种能够代谢机体羰基化合物的酶类。在结构上，AKR超家族都包含一个(α/β)8的桶状结构、相似的辅酶结合结构域和一个高度保守的Asp，Tyr，Lys，His催化四分体。在功能上，AKR不仅在生物体应对外源性或内源性羰基化合物解毒过程中具有重要作用，还参与了生物体内氧化应激、致癌化合物的降解、糖尿病并发症及肿瘤发生等过程。通过辅酶NAD(P)H提供还原力，AKR可以将醛酮类化合物通过加氢的方式还原成相对应的醇类化合物，从而降低毒害作用。其底物包括脂肪类醛酮化合物、芳香类化合物、醛糖、儿茶酚胺、甾类、视黄醛、前列腺素、黄曲霉素等。研究发现，AKR除了参与机体的疾病发生过程，还作为重要的防御酶存在。AKR抑制剂在癌症及糖尿病并发症临床治疗等方面具有重要的意义，目前已成为研究的热点。相比哺乳动物，对于鱼类AKR的研究报道较少。国外有学者研究了苯并芘(BaP)处理罗非鱼后其肝组织AKR1A1基因的表达情况，认为罗非鱼的AKR1A1可能在BaP解毒过程中具有重要的作用。除此之外，其它鱼类的AKR基因及其功能的研究国内外尚无报道。从黄鳝(Monopterusalbus)中克隆到醛酮还原酶(Eakr)基因，对其进行体外表达、多克隆抗体制备及抗体检测的研究，对于进一步探索鱼类醛酮还原酶基因的功能具有重要意义。技术实现要素：有鉴于此，有必要提供一种能制备出大量高质量的抗黄鳝Eakr的多克隆抗体的黄鳝Eakr多克隆抗体的制备方法。一种黄鳝Eakr多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：按照Trizol试剂说明书提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计引物，进行PCR扩增,获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；根据SmartRACE试剂盒说明书，进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得其全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计一对特异性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分别在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-Eakr；步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：将步骤(2)得到的重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导，培养3h。离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS-PAGE电泳检测纯化后的黄鳝Eakr重组蛋白；步骤(4)多克隆抗体的制备及Westernblot分析：将步骤(3)纯化的黄鳝pET-Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1︰1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射，免疫剂量为0.2mg；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，免疫血清储存于-80℃备用。提取经IPTG诱导和未诱导的pET-Eakr重组菌的融合蛋白进行Westernblot，检测抗体的特异性；为进一步分析黄鳝pET-Eakr多克隆抗体的特异性，利用动物组织总蛋白提取试剂盒提取黄鳝肝胰组织、小肠、肌肉和脾脏4种组织的总蛋白；取50μg各组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。用制备的抗血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测；步骤(5)免疫组化分析：采用石蜡包埋法包埋黄鳝的小肠、肝胰组织和脾脏,以6μm厚度进行切片；常规脱蜡后，用50μL的H2O2(3％)于37℃孵育10min，阻断内源过氧化物酶；将切片放入柠檬酸盐缓冲液中并加热至沸腾，20min后自然冷却；用10％山羊血清进行封闭后加入500倍稀释的兔抗Eakr抗血清37℃温育2h，用TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，DAB显色；苏木精复染、脱水透明及树胶封片。阴性对照以阴性血清代替一抗；步骤(6)其他鱼类Eakr同源蛋白的Westernblot分析：采用动物组织总蛋白提取试剂盒提取草鱼、黄颡、团头鲂、乌鳢和鲫鱼肝脏总蛋白，将50μg不同种鱼来源的肝脏总蛋白进行常规SDS-PAGE电泳及转膜；用自制的兔抗Eakr血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，Westernblot检测其他鱼类是否存在Eakr同源蛋白；步骤(7)多克隆抗体的效价测定：以纯化的重组蛋白为包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清为阴性对照，将兔抗Eakr抗体进行1：200至1：25600倍比稀释，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，以TMB为底物显色液，进行间接ELISA分析；以兔抗Eakr抗体OD450nm值与阴性对照血清OD450nm值的比值≥2时为阳性作为判定标准，制备的兔抗Eakr抗体最大稀释度作为该抗体的有效效价。本发明与现有技术相比具有如下有益效果：1)本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。2)本发明的方法制备的黄鳝Eakr多克隆抗体具有很强的特异性，可用于免疫组化、免疫印迹等实验要求，建立体外免疫分析，为深入研究黄鳝Eakr的功能提供一个重要工具。3)本发明制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，可用于黄鳝免疫荧光染色激光共聚焦显微观察。4)本发明制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，还可用于其他鱼类Eakr的免疫检测。附图说明图1为黄鳝Eakr基因小量表达和纯化重组蛋白SDS-PAGE电泳图；图2为黄鳝Eakr重组蛋白的Westernblot检测图；图3为以兔抗黄鳝Eakr血清为一抗的黄鳝各组织蛋白的Westernblot检测图；图4为黄鳝小肠，肝胰组织与脾脏的抗血清免疫组化分析对比组图；图5为部分其他鱼类醛酮还原酶同源蛋白的Westernblot检测图；图6为兔抗黄鳝Eakr血清的效价测定结果示意图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明实施方式提供一种黄鳝Eakr多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1黄鳝Eakr基因的克隆：按照Trizol试剂说明书提取黄鳝总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA，cDNA第一链的合成根据SmartRACE试剂盒说明书进行，于﹣80℃低温保存。根据GenBank数据库已报道的AKR基因序列进行同源比对，设计特异性引物AKR-F(5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’)和引物oligod(T)(5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’)。以黄鳝cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；特异性引物AKR-F与oligod(T)的核苷酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。PCR反应体系(25μL)PCR反应程序：根据所得黄鳝Eakr基因cDNA片段设计特异性引物AKR-GSP5(5’-GTATCTCTTGTCGCTATAGTCCCACCAGTG-3’)和AKR-GSP3(5’-TGTGGGCTGCAGGCTAGGTGTCGC-3’)，特异性引物AKR-GSP5与AKR-GSP3的核苷酸序列分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。按照SmartRACE试剂盒说明书进行5’RACE和3’RACE扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端。将黄鳝Eakr基因的5’末端和3’末端进行拼接，获得其cDNA全长序列。黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。5’RACE-PCR扩增的反应体系为(50μL)：组成体积(μL)PCR-gradewater3510×BDAdvantagebuffer2PCRbuffer5dNTPMix(10mM)1μPM5GSP15’-RACE-ReadycDNA2150×BDAdvantage2PolymeraseMix13’RACE-PCR扩增的反应体系为(50μL)：组成体积(μL)PCR-gradewater3510×BDAdvantagebuffer2PCRbuffer5dNTPMix(10mM)1μPM5GSP13’-RACE-ReadycDNA2150×BDAdvantage2PolymeraseMix1反应条件为：步骤2黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因的cDNA序列，设计一对特异性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分别在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位点。以黄鳝cDNA为模板，采用引物re-ex-F和re-ex-R扩增黄鳝Eakr基因的成熟肽片段。特异性引物re-ex-F与re-ex-R的核苷酸序列分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示。PCR反应体系(25μL)：反应条件为：将PCR产物与重组表达载体pET-28a同时进行EcoRI和HindIII双酶切，分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上进行抗性筛选。挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中进行培养，37℃、220r/m，培养8h后用质粒提取试剂盒提取质粒，采用质粒PCR和双酶切的方法验证重组质粒。已成功构建重组表达载体，命名为pET-Eakr。步骤3黄鳝Eakr重组蛋白的表达和纯化：黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达：取1ng重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL的卡那霉素平板上进行抗性筛选，培养温度为37℃，培养时间为过夜培养。筛选结束后转至LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中培养，培养条件为37℃，200r/min。菌体进入指数生长期后加添加IPTG至终浓度0.1mmol/L，进行IPTG诱导培养3小时后离心收集菌体沉淀，超声波破碎，加入5×上样缓冲液进行12％常规SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况，重组蛋白分子量为37.7kDa。黄鳝Eakr重组蛋白的纯化：将上述经过IPTG诱导的菌液按照1：100的比例接种到500mLLB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中进行扩大培养，培养条件为37℃，200r/min培养时间为过夜培养。培养结束后，离心收集菌体沉淀，用50mmol/L的PBS(pH8.0)悬浮菌液，进行超声波破碎并收集沉淀部分，用裂解缓冲液(6mol/L盐酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/LPBSpH＝8.0)洗涤3次。加入适量裂解缓冲液溶解，对上清液进行过滤；滤液用1mL的亲和层析镍柱His-Binding-Resin进行纯化；纯化后的蛋白用不同浓度的盐酸胍缓冲液进行透析复性，盐酸胍缓冲液浓度为6、3、1.5、0.5、0.1mol/L，用透析袋浓缩透析液；将收集到的黄鳝Eakr蛋白用BCA法测蛋白浓度，并用常规SDS-PAGE法，检测重组蛋白的条带大小，检测结果如图1所示。结果表明，黄鳝Eakr重组蛋白为单一条带，分子量为37.7kDa，其中M为DNA分子量标准；CK1为阴性对照；CK2为阳性对照；1为重组质粒pET-Eakr小量诱导产物；2为纯化的Eakr重组蛋白。步骤4黄鳝Eakr重组蛋白多克隆抗体的制备：将纯化的黄鳝Eakr重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化；用背部皮下多点注射法，按0.2mg的免疫量对新西兰大白兔进行免疫，采集保存第一次免疫前新西兰大白兔的血清。用经弗氏不完全佐剂充分乳化的抗原进行加强免疫，每次间隔7天，共注射8次。末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗黄鳝Eakr血清，加入30％甘油，于-20℃分装保存。将含有空白质粒的菌株总蛋白(阴性对照)、阳性菌株总蛋白(阳性对照)和纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。分别用武汉博士德生物有限公司制备的anti-His(1：2000倍稀释)及自制的兔抗血清1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测。以第一次免疫前采集的兔血清为阴性对照。检测结果如图2所示，自制的兔抗Eakr抗血清也可以特异性地和纯化的蛋白产生一条特异条带；在和重组菌总蛋白反应时产生了一条分子量较小的条带，可能是过量表达的杂蛋白产生的非特异性反应导致；其中1为重组大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白；2为纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；a为商品anti-His作为一抗；b为用自制的兔抗Eakr血清作为一抗。为进一步分析自制的抗血清的特异性，利用动物组织总蛋白提取试剂盒提取黄鳝肝胰组织、小肠、肌肉和脾脏4种组织的总蛋白。提取方法按照试剂盒说明书进行。总蛋白提取后取50μg各组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。用制备的抗血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测。检测结果如图3所示，来源于肝胰组织、小肠、肌肉和脾脏的总蛋白都可以和自制的兔抗Eakr血清产生特异性的反应，而且四种组织里带型和分子量大小均一致，为37.7kDa。步骤5黄鳝Eakr蛋白的免疫组化分析：采用石蜡包埋法包埋黄鳝的小肠、肝胰组织和脾脏，以6μm厚度进行切片。常规脱蜡后，用50μL的H2O2(3％)于37℃孵育10min，阻断内源过氧化物酶。将切片放入柠檬酸盐缓冲液中并加热至沸腾，20min后自然冷却。用10％山羊血清进行封闭后加入500倍稀释的兔抗黄鳝Eakr血清37℃温育2h，用TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，DAB显色。苏木精复染、脱水透明及树胶封片。阴性对照以实施例3中，多克隆抗体的制备步骤中的第一次免疫前新西兰大白兔的血清代替一抗。分析结果如图4所示，由免疫组化分析结果可知，黄鳝Eakr蛋白在黄鳝小肠中的整体分布较为分散，且在肠道内壁突出的绒毛根部分布相对较多，在肝胰组织和脾脏中分布较为集中，主要在肝胰组织和脾脏中的部分细胞中表达；其中图a、c、e为阴性对照效果图；b、d、f为经过兔抗黄鳝Eakr血清处理的效果图。而阴性对照未检出醛酮还原酶蛋白的表达。步骤6其他鱼类Eakr同源蛋白的Westernblot分析：为验证部分其他鱼类体内是否存在醛酮还原酶同源蛋白，进行了Eakr同源蛋白的Westernblot分析。具体过程如下：用动物组织总蛋白提取试剂盒提取草鱼、黄颡、团头鲂、乌鳢和鲫鱼肝脏总蛋白，各取50μg所提取的蛋白进行常规SDS-PAGE纯化分离并转膜。以兔抗黄鳝Eakr血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行Westernblot检测，观察其是否有特异性反应。检测结果如图5所示，所检测的5种淡水鱼的肝脏组织总蛋白都可以特异性的和制备的多抗产生反应，且5种鱼的醛酮还原酶同源蛋白分子量比较一致，分子量大小为37.7kDa，说明鱼类的醛酮还原酶存在于不同物种；其中M为DNA分子量标准；1为草鱼；2为黄颡；3为团头鲂；4为乌鳢；5为鲫鱼。步骤7多克隆抗体的效价测定：为了对所获得的多克隆抗体的效价进行测定，具体过程如下：以实施例4中，多克隆抗体的制备步骤中的第一次免疫前新西兰大白兔的血清为阴性对照，以最后一次免疫后收集的兔抗黄鳝Eakr血清在1：200至1：25600倍之间稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，以TMB作为显色液，以兔抗黄鳝Eakr血清样品OD450nm值与阴性对照血清OD450nm值的比值≥2时为阳性作为判定标准，以制备的兔抗黄鳝Eakr血清最大稀释度作为该抗体的有效效价。检测结果如图6所示，阳性血清的最高稀释度为1：12800，有效效价达到1：6400；其中纵坐标为OD450nm吸光值，横坐标为兔抗Eakr血清的稀释倍数范围值；比较对象为阴性血清与兔抗血清。本发明与现有技术相比具有如下有益效果：1)本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。2)本发明的方法制备的黄鳝Eakr多克隆抗体具有很强的特异性，可用于免疫组化、免疫印迹等实验要求，建立体外免疫分析，为深入研究黄鳝Eakr的功能提供一个重要工具。3)本发明制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，可用于黄鳝免疫荧光染色激光共聚焦显微观察。4)本发明制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，还可用于其他鱼类Eakr的免疫检测。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。<110>长江大学<120>一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法<160>8<210>1<211>1320<212>DNA13>黄鳝（Monopterusalbus）<400>1acgttagtctgctgctgttggttcgagcacagcttgtaaggaggacaaacttctttccca60gcccttgtagcaggatgcctgtggttcccaaagtgacactgcctgggggtctggagatct120gtcgggtcctgaatgggatgtggcaggtgtctggtaagcacggggcagtggatcgagcca180aagcagttgaggccatgcaggcctatgtagatgctggtctgaccacattcgacatggcag240acatttatgggcctgcagaggaaatatttgggcagttcaacagcaagctgaagtcctctg300gagatgctgcaccagctgtgcagagtctgaccaaatacgttccacaaccaggaccaatgg360accgcaaggtggtggagaaggcaatacagctctccatgactcggatgcaggtggacagtc420tggactgtgttcagtttcactggtgggactatagcgacaagagatacctggaggcactgg480gacacctgtttgatatgcaacaggagggactcatacgtgagctttccctcactaacttcg540acacacagagactggaggagatcagcaacagaggcatccgcatttccagcaaccaggttc600agtactctgtgattgaccagcgacctgcagtgaagatggaacagttctgtctggccaatg660acatccagctcctcacttatggcactctggctggcggtctgctcacagagcgctatctgg720gcaaggcggagccaaactccaaggcggagctctatactgcctccctctcaagctacaaga780agatgatcgacacttggggtggctggagccttttccaggacctacttgttactttggagg840ctgttgccaggagacacaactgccccatggcctgtgtcgcaacgcgttacgtgctggacc900gccctgcagtgggcggggtcattgtgggctgcaggctaggtgtcgcaaatgcggggcagc960acatcggtgacagtctgcatagctgcagccctgacctgcggttgacagcggaggatctcg1020ctgctatcaaagctgtgacacagcgctccagggacctcatggtgtggattggggactgcg1080gcgatgagtacaggagctaaaggcagaaggggtgaggaatagaggcagagtaaagggaaa1140catgcagcagtcacacatgcaacagaataaaatgcagctgctgctgaaaatcatttcaat1200cctccatttcatttttaattgaatcaaattagtttttgcataaagtctgtagctgttcct1260ctgttacacactataaagaaccaacagcaaattgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1320<210>2<211>341<212>PRT<213>黄鳝（Monopterusalbus）<400>2MetProValValProLysValThrLeuProGlyGlyLeuGluIleCys151015ArgValLeuAsnGlyMetTrpGlnValSerGlyLysHisGlyAlaVal202530AspArgAlaLysAlaValGluAlaMetGlnAlaTyrValAspAlaGly354045LeuThrThrPheAspMetAlaAspIleTyrGlyProAlaGluGluIle505560PheGlyGlnPheAsnSerLysLeuLysSerSerGlyAspAlaAlaPro65707580AlaValGlnSerLeuThrLysTyrValProGlnProGlyProMetAsp859095ArgLysValValGluLysAlaIleGlnLeuSerMetThrArgMetGln100105110ValAspSerLeuAspCysValGlnPheHisTrpTrpAspTyrSerAsp115120125LysArgTyrLeuGluAlaLeuGlyHisLeuPheAspMetGlnGlnGlu130135140GlyLeuIleArgGluLeuSerLeuThrAsnPheAspThrGlnArgLeu145150155160GluGluIleSerAsnArgGlyIleArgIleSerSerAsnGlnValGln165170175TyrSerValIleAspGlnArgProAlaValLysMetGluGlnPheCys180185190LeuAlaAsnAspIleGlnLeuLeuThrTyrGlyThrLeuAlaGlyGly195200205LeuLeuThrGluArgTyrLeuGlyLysAlaGluProAsnSerLysAla210215220GluLeuTyrThrAlaSerLeuSerSerTyrLysLysMetIleAspThr225230235240TrpGlyGlyTrpSerLeuPheGlnAspLeuLeuValThrLeuGluAla245250255ValA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