本发明属于多肽药物合成技术领域，特别是涉及一种比伐卢定的高效合成方法。
背景技术：
比伐卢定(Bivalirudin)是一种白色或类白色结晶性粉末，其序列为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，分子式为C98H138N24O33，分子量为2180.33。
比伐卢定合成的二十肽水蛭素衍生物，是直接的、特异的、可逆的凝血酶抑制剂，通过抑制凝血酶的活性位点而起效。冠心病作为常见心血管疾病之一，当出现冠状动脉内斑块破裂以及血栓等情况时，发病时间较快，这也是人们常说的畸形心肌梗死。过去往往是通过抗凝药肝素进行预处理，但肝素存在诱导血小板减少及肝素抵抗的局限性，比伐卢定作为一只新型抗凝药，具有抗凝效果的可预测性、不诱导血小板减少及对纤维蛋白结合的凝血酶有效等优势，克服了肝素、水蛭素的局限性，具有广泛的应用前景。
现有的比伐卢定合成方法，CN201210428012.5及CN201510776607.3等采用片段合成法，CN201110162887.0及CN200910028793.7等采用液相合成法，均以片段合成法为主要步骤，合成周期长，需要经过多步切割反应、工艺复杂，生产成本高，不利于比伐卢定的大规模生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种比伐卢定的高效合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产比伐卢定产品的广泛应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种比伐卢定的高效合成方法，包括如下具体步骤：
(1)、以2-Cl Resin为起始树脂载体，通过固相合成法，依次缩合比伐卢定序列中相对应的氨基酸，缩合产物产物采用特异性微波技术反应，得到比伐卢定-2-Cl-Resin；
(2)、将比伐卢定-2-Cl-Resin进行切割、沉降反应，得到比伐卢定粗肽；
(3)、将比伐卢定粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，冻干，得到比伐卢定纯品。
进一步地，步骤(1)中所述2-Cl Resin的取代度为0.64mmol/g。
进一步地，所述步骤(1)中缩合反应以DIC/HOBt为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为25-30min。
进一步地，步骤(1)中所述特异性微波反应技术步骤为：缩合反应进行15-20min后，将Fmoc-比伐卢定-2-Cl Resin使用特异性的微波合成反应20s。
进一步地，步骤(1)中所述固相合成法缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，缩合反应中氨基酸投料量为2-3倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为25℃。
进一步地，步骤(1)中所述脱除保护基反应中的脱保护试剂为20％哌啶/DMF溶液，洗脱时间为20min。
进一步地，步骤(2)所述切割沉降反应步骤为：树脂切割两次，将切割试剂吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到比伐卢定粗肽产品。
进一步地，所述切割试剂为TFA、水和TIS的混合溶液，其中，所述TFA、水和TIS的体积比为38：1：1，所述切割试剂体积为反应器容积的1/2。
进一步地，步骤(3)所述反相高效液相色谱法纯化，纯化选用C18，10um制备柱，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，以B.Cone/％(2→55)，Time.0→30min的梯度程序进行多肽的分离提纯。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的比伐卢定，称量后经分析计算，目标纯品比伐卢定的纯度为99％，其纯品收率为65.8％，与现有技术相比较，产品收率有大幅度地提高，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产比伐卢定产品的广泛应用前景。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
S1、2-Cl-Resin的溶胀
称取2-Cl-Resin 1g从开口端加入至多肽合成反应器中，于多肽合成反应器中加入DCM溶液浸没2-Cl-Resin，溶胀30min后抽干溶剂；
其中，2-Cl-Resin取代度为0.64mmol/g；
S2、比伐卢定-2-Cl-Resin的合成
比伐卢定-2-Cl-Resin为：
(D-Phe)-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-Cl-Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1～20个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表1所示：
表1
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Pip：六氢吡啶
TFA：三氟醋酸
tBu：叔丁基
OtBu：氧叔丁基
Trt：三苯甲基
DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
TIS：三异丙基硅烷
S2-1、Fmoc-Leu-2-Cl-Resin的合成方法
称取110mg的保护氨基酸Fmoc-Leu-OH和115mg HOBT加入10mL离心管中，同时加入3mL DCM溶液溶解，于该离心管中用滴管滴入适量催化剂DIEA溶液，活化20s；
将活化后的溶液与S1中溶胀后的2-Cl-Resin混合后加入至多肽合成反应器中反应50min，反应结束后抽干溶剂，得到Fmoc-Leu-2-Cl-Resin；
S2-2、Fmoc-Leu-2-Cl-Resin的封头反应方法
配制脱保护溶液，所述脱保护溶液为甲醇与DIEA的混合溶液，其中，甲醇与DIEA溶液的体积比1:1，将5mL脱保护溶液与Fmoc-Leu-2-Cl-Resin加入至多肽合成反应器中封掉树脂上的反应活性位点，将多肽合成反应器置于20-30r/min的摇床上摇动20min；
S2-3、树脂的洗涤方法
用真空泵抽干多肽合成反应器中的脱保护溶液，同时加入DMF溶液洗涤树脂，所述DMF溶液加入体积为多肽合成反应器体积的1/3-1/2，将多肽反应器置于脱色摇床上摇动60s，抽干DMF溶液，重复操作3次；
S2-4、Fmoc保护基的脱除方法
于S2-3的多肽合成反应器中加入20％哌啶/DMF脱保护溶液脱除氨基保护基FMOC，其中，所述20％哌啶/DMF脱保护溶液体积为多肽合成反应器体积的20％-30％；
将多肽合成反应器置于30r/min的脱色摇床上摇动反应20min，反应结束后，抽干溶剂；
S2-5、保护氨基酸的活化方法
称取572mg保护氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH和115mg HOBT加入10mL离心管中，同时加入3mL DCM溶液溶解，于该离心管中用滴管滴入适量催化剂DIEA溶液，活化20s后得到保护氨基酸溶液；
S2-6、比伐卢定-2-Cl-Resin的合成方法
将保护氨基酸溶液加入至S2-5中多肽合成反应器中与树脂反应，将多肽合成反应器25℃的恒温震荡器中反应20-30min，反应结束后将多肽合成反应器置于微波化学反应器中微波反应20s，洗涤树脂；
依照上述步骤于树脂上依次接上Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH氨基酸，得到比伐卢定-2-Cl-Resin；
S3、比伐卢定-2-Cl-Resin的切割方法
配制100ml切割试剂：95ml TFA+2.5ml水+2.5ml TIS，保藏于棕色试剂瓶中，将比伐卢定-2-Cl-Resin加入至切割试剂中，置于多肽合成反应器中反应，切割结束后，加入35ml冰乙醚至50ml离心管中，将多肽合成反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min离心3min，弃上清，重复操作3次得到乳胶状的比伐卢定粗肽；
所述比伐卢定粗肽为：
(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu；
S4、比伐卢定粗肽的纯化方法
将比伐卢定粗肽溶解并过滤，将粗肽溶液经反相高效液相色谱法纯化得到比伐卢定纯品，其中，纯化条件为，色谱柱为C18，10μm制备柱，流动相为A(0.1％TFA/水)/B(0.1％TFA/乙腈)，梯度程序为
收集目标比伐卢定溶液，冷冻干燥后称重，计算RGD环肽纯品收率为65.8％，纯度为99％。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。