本发明属于多肽药物合成的技术领域，特别涉及一种索玛鲁肽的固相合成方法。
背景技术：
中文名称：索玛鲁肽
英文名称：Sermaglutide
序列：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
分子式：C187H291N45O59
分子量：4113.64
索玛鲁肽(Sermaglutide)一种新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，每周皮下注射一次，可使2型糖尿病患者血糖水平大幅改善，并且低血糖风险较低。同时，索玛鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽的脂肪连更长，疏水性强，但是索玛鲁肽经过短链的PEG修饰，亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。索马鲁肽与艾塞那肽相比，提供了更好的血糖控制及体重减轻。索玛鲁肽具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。
现有的索玛鲁肽合成方法多为固液合成法，CN201410573312.1的合成方法，合成周期长，生产成本高，不利于索玛鲁肽的大规模生产。本发明提供一种合成索玛鲁肽的优化工艺以造福于人类健康。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种索玛鲁肽的固相合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产索玛鲁肽粗肽产品的广泛应用前景，以用于大规模生产索玛鲁肽。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种索玛鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)以Dde-Lys(Fmoc)-OH为原料，脱除赖氨酸的Fmoc保护基，然后依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，进行赖氨酸的改造缩合反应，得到如下肽链：
Dde-K(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin
(2)以2-Cl-Resin为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接索玛鲁肽序列中相对应的氨基酸，并采用特异性微波技术反应，得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin如下：
H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG-2-Cl-Resin
(3)进行切割沉降反应，冻干，得到索玛鲁肽粗肽如下：
H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG
上述固相合成方法中，步骤(1)所述赖氨酸的改造缩合反应指的是：脱除赖氨酸的侧链保护基Fmoc，通过固相合成法，在赖氨酸侧链依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸；然后脱除赖氨酸的Dde保护基，Dde的脱除试剂为水合肼：DMF＝1:15体积比的混合溶液，得到改造后的赖氨酸肽链。
步骤(2)所述氯树脂优选为2-Cl(Trt)-Cl Resin，反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，所述特异性微波技术指在氨基酸缩合反应15min后，将索玛鲁肽-2-Cl Resin置于微波化学反应器中微波反应20s，得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin。
步骤(3)所述切割沉降反应，切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2体积比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次，得到索玛鲁肽粗肽产品。
本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，对赖氨酸原料进行了改造，大大简化了工艺流程，缩合反应中采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率；本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。
一种索玛鲁肽的固相合成方法，采用固相合成法，起始载体选用2-Cl-Resin为载体，经活化剂和缩合剂的缩合反应，并采用特异性微波技术反应，以保护氨基酸为缩合原料，依次缩合索玛鲁肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，其中赖氨酸采用Dde-Lys(Fmoc)-OH，脱除赖氨酸侧链保护基Fmoc，进行原料的改造，然后通过固相合成法缩合到肽链上；进行切割、沉降反应，冻干得到索玛鲁肽产品。
实施例一 赖氨酸原料的改造
(1)侧链氨基酸的连接
加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min，脱除赖氨酸的Fmoc侧链保护基，按固相氨基酸的缩合方法，在赖氨酸侧链依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，缩合成功后用DMF洗5次，抽干。
(2)脱除Dde保护基
按照水合肼：DMF＝1:15配置脱除溶液，每次用三倍树脂体积的混合溶液洗脱，震荡反应5min后用DMF洗涤3次，第3次水合肼溶液脱Dde后，DMF洗涤5次，得到改造后的赖氨酸肽链。
实施例二 索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
1.2-Cl-Resin的溶胀
称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。
2.索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
索玛鲁肽-2-Cl-Resin为：
H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG-2-Cl-Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-31个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Pip：六氢吡啶
TFA：三氟醋酸
tBu：叔丁基
DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
(1)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的合成
称取120mg Fmoc-Gly-OH和130mg HOBt放于10ml离心管中，加3ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1h。
(2)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的封头反应
配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
(3)树脂的洗涤方法
用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。
(4)脱除Fmoc保护基
加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(5)保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-Cl-Resin的缩合为例，称取585mg Fmoc-Arg(pbf)-OH和130mg HOBt放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(6)索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应20-30min，然后将反应器置于微波化学反应器中微波反应20s后洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-31个保护氨基酸，即得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin。
实施例三 索玛鲁肽粗肽产品的切割沉降
(1)配置切割试剂
100ml配方为:87.5mlTFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mlEDT+5g苯酚，置于棕色试剂瓶中。现配备用，配制量一般为1g树脂加10ml切割试剂。
(2)索玛鲁肽-2-Cl-Resin的切割
向抽干的反应器中加入切割试剂，置于脱色摇床上摇晃反应1h，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到索玛鲁肽粗肽产品。
实施例四 索玛鲁肽粗肽产品的收率
切割沉降后的粗品呈乳胶状态，其中含有较多的TFA盐和切割试剂，本发明采用C18色谱柱进行除盐，以便计算粗品得率。
将样品溶解并过滤，采用流动相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下梯度程序进样分析：
称量冻干后的索玛鲁肽粗肽产品，质量为1045mg，经计算粗品收率为82.5％，比现有技术仅50-70％的收率有大幅度提高。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。