本发明涉及基因工程
技术领域：
：，尤其涉及一种采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法。
背景技术：
：：生物地磁导航普遍存在于生物界内。鸽子、园林莺、罗宾鸟等鸟类和其它一些生物如海龟、棕蝠、加勒比海多刺龙虾、红蜥蜴，甚至是果蝇等昆虫也具备地磁感应能力。目前，国内外对生物地磁导航进行了大量研究，主要集中在动物行为学和理论模拟计算上。针对其具体生物生理机制已有不少研究，也提出了一些假设和解释，但仍然存在诸多不明确的方面，也未达成很好的共识。隐花色素(Cryptochrome，Cry)蛋白，被认为是生物体内最可能的地磁敏感物质。其作为生物最可能的地磁响应机制—自由基对机理中的关键蛋白，一直以来都受到广泛关注。研究认为隐花色素Cry在受到光激发后，蛋白上的色氨酸残基Trp会和蛋白辅基FAD发生光诱导电子转移反应而形成一对自由基对FADH°-Trp°中间态产物。这个中间态的寿命受地磁场影响，而某些生物就通过特定的方式感应到这种微弱变化，进而对地磁场做出响应。由此可见，对Cry蛋白光化学反应的磁响应过程开展研究，对揭示生物地磁导航机制具有重要意义。体外获取Cry蛋白是开展相关研究的必要物质基础。目前国内外普遍采用异源表达系统获取Cry蛋白。有文献报道采用昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统等真核表达系统表达磁导航鸟类园林莺的隐花色素gwCry，但表达量只有2μg/L。我们实验室前期也采用昆虫杆状病毒表达系统成功获得鸽子ColumbialiviaCryptochrome1(ClCry1)活性蛋白，但在实验中也发现，这种表达存在较多问题，首先就是操作繁琐、成本高，其次表达量低、蛋白易降解、辅基易脱落。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单、快速、低成本的，能高效表达鸽子磁敏蛋白ClCry1的方法。为解决上述技术问题，提供了一种采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法，包括以下步骤：S1、提取含ClCry1的目的基因；S2、双酶切目的基因片段和载体；S3、将酶切后的目的基因连接到载体上得到重组载体；S4、将所述重组载体转化至感受态细胞中，筛选阳性克隆；S5、将所述阳性克隆进行培养、蛋白表达、纯化得到鸽子磁敏蛋白。上述的方法，优选的，所述S1步骤具体为：S1-1、设计含HindIII和BamHI酶切位点的引物；S1-2、以含ClCry1的目的基因的载体为模板，通过S1-1中设计的引物进行PCR扩增获得扩增产物，即为含ClCry1的目的基因。上述的方法，优选的，所述含HindIII和BamHI酶切位点的引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。SEQIDNO.1所示的序列具体为：CGCGGATCCGCGATGGGGGTGAACGCCGT。SEQIDNO.2所示的序列具体为：CCCAAGCTTGGGTGTGCTCTGTCGCTGGACT。上述的方法，优选的，所述S2步骤中采用HindIII和BamHI对所述目的基因和载体进行双酶切。上述的方法，优选的，所述载体为pet21a载体。上述的方法，优选的，所述S4步骤中所述转化方法为：将重组载体加入大肠杆菌感受态细胞中，冰内放置30min～50min，42℃热激80s～90s，然后立即置于冰中3min～8min，加入无抗生素LB培养基，37℃摇床培养45min～60min，取出置于离心机内常温5000rpm～6000rpm离心1min，去掉离心后的上清液，取重悬菌体均匀涂布于含有Amp的固体培养基上，置于37℃培养箱内培养过夜。上述的方法，优选的，所述S5步骤中所述培养方法为：将所述阳性克隆置于含Amp的LB培养基内37℃摇床培养12h～16h获得阳性转化菌液。上述的方法，优选的，所述S5步骤中所述蛋白表达的方法为：将培养后的阳性转化菌液接种到含Amp的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6～0.8之间；然后加入IPTG诱导剂，在16℃～30℃下继续培养10h～24h。进一步优选的，培养时间为14h～24h。所述阳性转化液的接种比例为1％～5％(体积百分含量)。上述的方法，优选的，所述IPTG诱导剂的浓度为0.1mM～1mM。上述的方法，优选的，所述S5步骤中所述纯化的具体包括以下步骤：S5-1、将经过蛋白表达后的菌液置于冰上停止表达，然后离心收集菌体；S5-2、在收集的菌体中加入裂解液于冰上裂解得到裂解后的菌体；S5-3、将所述裂解后的菌体超声破碎、离心，收集离心后的上清液；S5-4、将所述上清液倒入含镍柱的纯化柱中，使蛋白与镍柱结合；S5-5、排出流出液，然后用洗涤液洗脱杂蛋白；S5-6、加入目的蛋白洗脱液洗脱，得到鸽子磁敏蛋白。上述的方法，优选的，所述S5-1步骤中，所述经过蛋白表达后的菌液置于冰上10min～20min，使其停止表达；然后于4℃、5000rpm～8000rpm条件下离心10min～20min，倒掉上清，收集菌体；和/或，所述S5-2步骤中，在收集好的菌体中加入40mL～60mL配制好的裂解液，混匀，于冰上裂解30min～40min得到裂解后的菌体；和/或，所述S5-3步骤中，将裂解后的菌体进行超声波破碎，超声时设置工作时间5s，休息10s，功率30，共超声10min；超声完成后，置于冰上使其冷却；然后将液体倒入离心管内于4℃、10000rpm～15000rpm条件下离心50min～60min得到上清液和沉淀；和/或，所述S5-4步骤中，将所述上清液倒入含镍柱的纯化柱中，将柱子置于4℃，避光条件下缓慢旋转10min～60min使蛋白与镍柱结合。和/或，所述S5-5步骤中，所述洗涤液包括70mM～90mM的咪唑溶液；和/或，所述S5-6步骤中，所述目的蛋白洗脱液包括250mM～500mM的咪唑溶液。上述的方法，优选的，所述鸽子磁敏蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述SEQIDNO.3所示的序列，具体为：MGVNAVHWFRKGLRLHDNPALRECIQGADTVRCVYILDPWFAGSSNVGINRWRFLLQCLEDLDANLRKLNSRLFVIRGQPADVFPRLFKEWNITKLSIEYDSEPFGKERDAAIKKLASEAGVEVIVRISHTLYDLDKIIELNGGQPPLTYKRYQTLISRMEPLEMPVETITPEVMEKCTTPVSDDHDEKYGVPSLEELGFDTDGLPSAVWPGGETEALTRLERHLERKAWVANFERPRMNANSLLASPTGLSPYLRFGCLSCRLFYFKLTDLYKKVKKNSSPPLSLYGQLLWREFFYTAATNNPRFDKMEGNPICVQIPWDKNPEALAKWAEGRTGFPWIDAIMTQLRQEGWIHHLARHAVACFLTRGDLWISWEEGVKVFEELLLDADWSVNAGSWMWLSCSSFFQQFFHCYCPVGFGRRTDPNGDYIRRYLPVLRGFPAKYIYDPWNAPESIQKAAKCIIGVNYPKPMVNHAEASRLNIERMKQIYQQLSRYRGLGLLATVPSNPNGNGNGGLMGYSPGESISGCGSTGGTQLGTGDGQAVVQPCALGDSHTGASGVQQQGYCQASSILHYAHGDNQQSHLLQAGRTALGTGISAGKRPNPEEETQSVGPKVQRQSTN。鸽子磁敏蛋白是由620个氨基酸组成，分子量为69.6KDa，等电点为7.53。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法，首次采用原核表达系统进行鸽子磁敏蛋白ClCry1的表达，并成功获得优化的Cry蛋白表达模板和高效表达的技术条件，利用这项发明技术，可使蛋白表达量提高到1.5mg/L。并且，原核表达系统在技术复杂和成本花费上都比较低，因而，更方便获得满足需求的大量蛋白，为后续磁导航鸟类Cry磁敏蛋白结构和机制的研究工作提供了一个很好的物质保障，对揭开动物磁导航行为的神秘面纱具有重要意义。(2)本发明提供了一种采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法，首次使用了低温诱导的方法，显著降低了包涵体蛋白的表达量，使得可溶性的蛋白表达量显著提高。(3)本发明提供了一种采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法，选择了原核表达载体pet21a，只含有一个简单的His-tag标签，这样对表达获得的目的蛋白结构影响最小，同时也便于后期的切除标签。附图说明为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为本发明实施例1的pFastBacHTA载体图谱。图2为本发明实施例1的pet21a载体图谱。图3为本发明实施例1的PCR获得的用于连接pet21a载体的ClCry1基因片段。图4为本发明实施例1的菌落PCR结果。图5为本发明实施例1的测序DNA序列对比结果。图6为本发明实施例1的氨基酸序列对比结果。图7为本发明实施例1的表达蛋白westen-blot分析结果。图8为本发明实施例1的表达蛋白SDS-PAGE分析结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1：1、获取目的基因序列：以实验室已有含ClCry1基因序列的pFastBacHTA载体为模板(pFastBacHTA载体的图谱参见图1)，以HindIII和BamHI为酶切位点设计引物，用PCR的方式从pFastHTA载体上获得目的基因序列。pFastBacHTA载体上连接的ClCry1基因序列如下：ATGGGGGTGAACGCCGTGCACTGGTTCCGCAAGGGGCTGCGGCTCCACGACAACCCGGCGCTGCGGGAGTGCATCCAGGGCGCCGACACGGTCCGCTGCGTCTACATCCTGGACCCCTGGTTCGCCGGCTCTTCCAACGTGGGCATCAACAGGTGGCGATTCCTGCTTCAATGTCTTGAGGATCTTGATGCCAATCTACGGAAACTGAATTCACGTTTGTTTGTTATTCGTGGACAGCCAGCAGATGTTTTCCCCAGACTTTTTAAGGAATGGAATATTACAAAACTTTCTATTGAATATGATTCTGAACCATTCGGGAAGGAAAGAGATGCAGCGATTAAGAAGTTGGCTAGTGAAGCTGGAGTGGAGGTCATTGTTCGAATTTCCCACACATTATATGACCTAGACAAAATAATAGAATTAAATGGAGGACAACCTCCTCTTACTTACAAGCGATACCAGACCCTAATTAGCAGAATGGAGCCACTAGAGATGCCAGTGGAGACTATAACCCCAGAAGTAATGGAAAAATGTACTACTCCAGTTTCTGATGACCATGACGAGAAATACGGTGTCCCATCACTTGAAGAGCTAGGTTTTGACACAGATGGTTTGCCTTCTGCAGTATGGCCAGGGGGAGAAACAGAAGCTCTCACACGATTGGAAAGACATTTAGAACGAAAGGCTTGGGTAGCAAACTTTGAAAGACCACGAATGAATGCGAATTCCCTTCTGGCAAGCCCTACGGGGCTTAGTCCCTACCTCCGCTTTGGCTGTTTGTCCTGTCGTCTCTTTTATTTCAAGTTAACGGATCTGTACAAAAAGGTAAAAAAGAACAGCTCCCCTCCCCTCTCCCTCTATGGCCAGCTGTTATGGCGTGAATTTTTCTACACAGCGGCAACTAACAATCCACGGTTTGATAAAATGGAGGGGAATCCTATCTGTGTTCAAATTCCATGGGATAAGAATCCTGAGGCTTTGGCCAAGTGGGCAGAAGGCAGGACAGGTTTTCCTTGGATTGATGCAATTATGACACAGCTTCGTCAGGAAGGTTGGATTCACCATTTAGCCCGGCATGCTGTAGCATGCTTTTTGACTCGAGGTGACCTCTGGATTAGCTGGGAAGAAGGAGTGAAGGTCTTTGAAGAGCTCTTACTTGATGCAGATTGGAGTGTAAATGCTGGAAGCTGGATGTGGCTCTCCTGTAGTTCCTTCTTTCAGCAGTTTTTTCACTGCTACTGTCCAGTGGGTTTTGGCAGAAGAACTGACCCAAATGGGGATTATATCAGACGTTATTTACCAGTACTTAGAGGCTTCCCTGCAAAATACATCTATGATCCTTGGAATGCCCCAGAGAGCATCCAGAAGGCTGCAAAATGTATTATAGGAGTTAATTATCCCAAACCAATGGTAAATCATGCAGAGGCAAGCCGTCTGAATATTGAGAGGATGAAACAAATCTACCAGCAGCTTTCACGATACAGAGGACTGGGTCTTCTTGCAACAGTGCCTTCTAATCCAAATGGAAATGGAAATGGTGGCCTAATGGGCTATTCACCAGGCGAAAGCATTTCTGGTTGTGGTAGTACAGGAGGAACTCAGCTGGGAACTGGTGACGGTCAGGCAGTTGTTCAGCCGTGTGCCCTGGGAGACTCGCATACAGGAGCAAGCGGAGTACAGCAGCAAGGTTACTGTCAAGCAAGTAGTATCTTACACTATGCTCATGGAGACAATCAGCAATCGCACTTATTGCAAGCAGGACGAACAGCCCTTGGTACTGGCATTAGTGCAGGGAAACGCCCAAATCCAGAAGAAGAAACTCAGAGCGTTGGACCAAAAGTCCAGCGACAGAGCACAAATTAA。具体方法包括以下步骤：1.1选择酶切位点：选择pet21a做为表达载体(图2为pet21a载体图谱)，根据其多克隆位点所提供的酶切位点，选择ClCry1基因序列中所不含有的酶切位点。本文选择HindIII和BamHI做为酶切位点。1.2设计PCR引物：设计含HindIII和BamHI酶切位点及其保护碱基的引物。HindIII：CCCAAGCTTGGG；BamHI：CGCGGATCCGCG；上游引物：CGCGGATCCGCGATGGGGGTGAACGCCGT(SEQIDNO.1)；下游引物：CCCAAGCTTGGGTGTGCTCTGTCGCTGGACT(SEQIDNO.2)。1.3PCR反应：以含ClCry1基因序列的pFastHTA载体为模板，通过步骤1.2的上游引物和下游引物进行PCR扩增获得PCR产物。表1为PCR反应体系1，表2为PCR反应条件。表1：PCR反应体系组分体积/μLrTaqenzyme(DNA聚合酶)0.510×Buffer5dNTPs4上游引物(10μM)2.5下游引物(10μM)2.5cDNA2ddH2O33.5体系总体积50表2：PCR反应条件1.4琼脂糖凝胶电泳：将步骤1.3中得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果参见图3。图3所示为PCR获得的用于连接pet21a载体的ClCry1基因片段pet21a/ClCry1。对凝胶电泳中的目的条带切胶回收。2、构建表达载体2.1双酶切pet21a载体和ClCry1基因片段；取步骤1中回收的琼脂糖凝胶(pet21a/ClCry1)置于表3的双酶切体系中，在37℃条件下双酶切反应1h得到酶切产物。表3：双酶切体系组分体积/μLBamHⅠ2.5HindⅢ2.510×Kbuffer5pet21a/ClCry120ddH2O20体系总体积50将酶切产物电泳然后进行胶回收。2.2连接：将ClCry1基因片段连接到pet21a载体上获得重组载体。采用DNALigationkitver2.1试剂盒进行连接反应，具体连接反应体系如表4所示。表4：连接反应体系组分体积/μLpet21a2ClCry12SolutionI(溶液I)10ddH2O6Total20将连接反应体系置于16℃条件下，反应30min，反应完成后取出，在反应体系中加入10μLSolutionIII(溶液III)，混匀得到混合溶液。2.3转化：取10μL上述步骤2.2的混合溶液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。具体步骤为：2.3.1将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰内放置30min，42℃热激90s，然后立即置于冰中5min，加入800μL无抗生素LB培养基，37℃摇床培养50min，取出置于离心机内常温5000rpm离心1min，倒掉部分上清，留存约100μL左右上清重悬细胞，然后将其均匀涂布于含有Amp的固体培养基上，置于37℃培养箱内培养过夜。2.3.2挑取含有Amp的固体培养基上的单菌落，置于表5的菌落PCR反应体系中进行菌落PCR得到PCR产物。F-Primer：CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC；R-Primer：GAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAG。表5：菌落PCR体系组分体积/μL10×DreamTaqBuffer5dNTPs4F-Primer(10μM)2.5R-Primer(10μM)2.5Template5DreamTaqDNApolymerse0.25ddH2O30.75Total50菌落PCR的反应条件参见表6。表6：菌落PCR反应条件2.3.3将反应后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。图4为菌落PCR结果；从图4中可知，挑取的6个单克隆全部都是阳性克隆。2.3.4将挑取的阳性克隆加入5mL含Amp的液体LB培养基中，置于37℃摇床中培养14h。然后采用天根的质粒小提试剂盒提取质粒，将其送上海生物工程有限公司进行测序。图5为DNA序列对比结果，图6为氨基酸序列对比结果。如图5和图6所示，检测的DNA序列与原始模板存在一个碱基的变化；但是翻译得到的氨基酸序列没有改变。至此，获取正确的基因序列并构建表达载体成功。3、ClCry1蛋白的表达3.1转化宿主细胞：将步骤2中构建好的重组载体(重组载体就是表达载体，一般在构建时习惯性称之为表达载体，构建成功后称之为重组载体)转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，转化方法和前面转化DH5α的方法(即2.3步骤)一样。转化成功后选取阳性单克隆扩大培养，具体为：将单克隆置于含Amp的5mL的LB培养基内，培养过夜或者14h左右；获得阳性转化菌液。3.2蛋白表达：将步骤3.1的阳性转化菌液按照2％的比例接种到2L含Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm条件下培养至OD600到0.6之间。然后加入诱导剂IPTG，使得IPTG的终浓度为1mM，置于16℃条件下，培养24h。3.3蛋白纯化步骤：3.3.1培养完成后收集菌液，置于冰上10min，使其停止表达；然后于4℃、5000rpm条件下离心15min，倒掉上清，收集菌体。3.3.2向收集好的菌体当中加入40mL配制好的裂解液(裂解液的成分为：50mMNa2HPO4，150mMNaCl，pH8.0)，混匀，于冰上裂解40min。3.3.3将裂解后的菌体进行超声波破碎，超声时设置工作时间5s，休息10s，功率30，共超声10min。3.3.4超声完成后，置于冰上5min，使其冷却；然后将液体倒入离心管内于4℃、15000rpm条件下离心60min得到上清液和沉淀。3.3.5吸取100μL上清(标记为可溶性上清蛋白)用SDS-PAGE和western-blot检测可溶性蛋白占表达蛋白的总量，其余上清轻轻地倒入到含镍柱的纯化柱中，将柱子置于4℃，避光条件下缓慢旋转60min，使蛋白与镍柱充分结合。3.3.6在此期间，将离心管内剩余的沉淀用同样体积的裂解液(裂解液的成分与3.3.2步骤一致)重悬，用SDS-PAGE和western-blot检测包涵体占表达蛋白的总量。3.3.7之后，将结合完成的柱子塞子取出，使其液体自然流出，待液体流至剩余2/3后，收集100μL左右流出液，用SDS-PAGE和western-blot检测蛋白结合情况。3.3.8液体流完后，塞住塞子，加入150mL含70mM咪唑的洗涤液洗杂蛋白；取出塞子，使液体自然流出，收集不同时间段的流出液各100μL左右，用SDS-PAGE和western-blot检测杂蛋白洗脱情况。3.3.9杂蛋白洗脱完成后，塞住塞子，加入8mL含500mM咪唑的目的蛋白洗脱液；置于4℃条件下，旋转混合30min，取出塞子，使液体自然流出，收集全部流出液，取出100μL左右流出液用SDS-PAGE检测目的蛋白洗脱情况。剩余液体置于-80℃冰箱内保存。3.4western-blot分析3.4.1处理检测样品：分别取13μL步骤3.3.5中的上清液、13μL步骤3.3.6中的悬浮液、15μL步骤3.3.9的目的蛋白、10μL步骤3.3.9的目的蛋白、13μL步骤3.1中的阳性转化菌液进行western-blot分析。具体处理体系参见表7。表7：样品处理体系组分体积/μL4×samplebuffer(SDS处理液)510×reducingAgentbuffe(还原剂)2样品10～15Total20将配制好的样品处理体系置于70℃条件下加热10min，即完成样品处理。3.4.2跑胶将蛋白质marker和按照步骤3.4.1处理好的检测样品，吸取20μL置于蛋白预制胶(预制胶为NuPAGE4-12％Bis-Tris，购买于lifetechnology公司)对应胶孔内，预制胶提前放入含缓冲液的蛋白质胶槽内。根据所使用的预制胶类型和缓冲液，选择合适的电压和时间，如200v，30min进行跑胶(跑胶条件还可以为165v，35min)。3.4.3转印PVDF膜跑完胶后，立即取出胶将其置于配制好的转膜液(转膜液的配制：取5.8g的Tris，2.9g的Gly，0.37g的SDS，适当水溶解，加入200mL甲醇，调节pH至8.3，最终定容为1L。)中，在摇床上轻轻摇动10min处理胶，以便更好的转膜，同时，剪裁比胶稍微大一点点大小的PVDF膜和滤纸，将滤纸置于转膜液中浸泡10min，PVDF膜先泡在甲醇中2min以活化膜，然后也置于转膜液中浸泡10min。处理完成后，取出三层滤纸，一层一层的放入转膜仪正中，每放一层用玻璃棒小心的赶掉气泡，然后放入PVDF膜，再放入胶，保持胶和膜的完全接触；再一层一层加入三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶掉气泡。这样，转膜“三明治”就算做好了。盖上转膜仪盖子，插上电源，打开转膜仪(型号为∶BIO-RADTRANS-BLOTSDSEMI-DRYTRANSFERCELL)，根据蛋白性质输入合适电压和时间进行转膜，如10v，45min(转膜条件还可以为15v，25min)。反应完成后即完成转膜。3.4.4封闭转膜完成后，小心的取出PVDF膜，立即将其置于配制好的封闭液中，置于摇床上缓慢摇动1h，使得膜上未被蛋白占据的位置充分被封闭。3.4.5洗膜封闭完成后，用洗膜液洗膜，10mL洗膜液(洗膜液体积为10～15mL均可)洗10min，共洗2次(洗涤2～3次均可)。3.4.6孵育加入含his-tag抗体的孵育液15mL，于摇床上缓慢摇动，4℃过夜。HisProbe-HRP3.4.7洗膜孵育完成后，用洗膜液洗膜，10mL洗膜液洗10min(10～15mL洗膜液洗10～15min均可)，共洗3次(3～4次均可)。3.4.8显色洗膜完成后，加入10mL配置好的显色液(显色液成分：1∶1的Supersignalwestpicoluminol/enhancersolution和Supersignalwestpicostableperoxidesolution，避光配制)，显色5min。置于显色仪器内进行拍照分析。拍照结果如图7所示，其中：第1道为marker。第2道为步骤3.3.6中检测包涵体占表达蛋白的总量，看其图上相应条带的粗细来判断的，可以看出包涵体蛋白占表达蛋白量的50％以下。第3道为步骤3.3.5中检测的可溶性上清蛋白占表达蛋白的总量，结果是看其图上相应条带的粗细来判断的，可以看出可溶性蛋白占表达蛋白量的50％以上。第4道和第5道分别是10μL、15μL步骤3.3.9中得到的目的蛋白，可以看出洗脱的目的蛋白条带单一，比较粗，说明目的蛋白获得量大且纯度高。第6道为步骤3.1中的阳性转化菌液；可以看出，单纯的阳性转化菌液没法大量表达蛋白，只是很少量的本底表达。只有添加诱导剂诱导以后才会大量表达。说明诱导表达的方法确实可行。同时，图中沉淀和可溶性上清的位置相对要大一些，可能原因是沉淀和上清中含有其它杂蛋白或者其它组分，因而分子量比较大，在胶图上的位置比较靠近后面，纯化蛋白由于被洗掉了杂蛋白和其它组分，因而只是目的蛋白本身的分子量，故在胶图上位置比较靠前。3.5、SDS-PAGE分析3.5.1.按照和western-blot分析相同的方法进行检测样品的处理和跑胶。3.5.2.跑胶完成后，取出胶置于配置好的固定液(固定液的成分：25％异丙醇，10％乙酸)中固定30min(20～40min均可)，倒掉固定液，加入卡马斯亮蓝染色液染色45min(染色30～60min均可)(考马斯亮蓝染色液成分为：10％乙酸，0.006％G-250)，染色完成后倒掉染色液，加入脱色液(脱色液为10％乙酸)脱色，直到可以看清条带为止。所得结果如图8所示：图中箭头所指的即为获得的目的蛋白。图8表达蛋白SDS-PAGE分析结果：第1道和第2道分别是10μL、15μL步骤3.3.9中得到的目的蛋白，可以看出洗脱的目的蛋白条带单一，比较粗，说明目的蛋白获得量大且纯度高。第3道和第4道分别为步骤步骤3.3.8中完全洗涤和洗涤一半时的收集液。因为杂蛋白是一点一点被洗下来的，150mL体积的洗涤液能否将杂蛋白洗完全并不知道，所以需要收集不同阶段的流出液，看看杂蛋白含量多少，如果越到后面，杂蛋白量越少，就说明洗的效果不错。第3道是洗涤完收集的，可以看出基本没有什么蛋白了，所以说明杂蛋白洗的效果很好。从图中可知杂蛋白基本被洗脱干净。第5道为穿透液，从图中可以看出穿透液中基本不含目的蛋白，说明蛋白基本100％结合在了镍柱上。第6道为上柱液，从第6道中可以看出蛋白太浓，看不清楚。但隐隐可以发现有很多各种各样的蛋白。第7道为marker。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。当前第1页1 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