采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法与流程

文档序号:12162298阅读:来源:国知局

技术特征:

1.采用原核表达体系获取鸽子磁敏蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、提取含ClCry1的目的基因;

S2、双酶切目的基因片段和载体;

S3、将酶切后的目的基因连接到载体上得到重组载体;

S4、将所述重组载体转化至感受态细胞中,筛选阳性克隆;

S5、将所述阳性克隆进行培养、蛋白表达、纯化得到鸽子磁敏蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S1步骤具体为:

S1-1、设计含Hind III和BamH I酶切位点的引物;

S1-2、以含ClCry1的目的基因的载体为模板,通过S1-1中设计的引物进行PCR扩增获得扩增产物,即为含ClCry1的目的基因。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述含Hind III和BamH I酶切位点的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S2步骤中采用Hind III和BamH I对所述目的基因和载体进行双酶切;所述载体为pet21a载体。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S4步骤中所述转化方法为:将重组载体加入大肠杆菌感受态细胞中,冰内放置30min~50min,42℃热激80s~90s,然后立即置于冰中3min~8min,加入无抗生素LB培养基,37℃摇床培养45min~60min,取出置于离心机内常温5000rpm~6000rpm离心1min,倒掉离心后的上清液,取重悬菌体均匀涂布于含有Amp的固体培养基上,置于37℃培养箱内培养过夜。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S5步骤中所述培养方法为:将所述阳性克隆置于含Amp的LB培养基内37℃摇床培养12h~16h获得阳性转化菌液。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S5步骤中所述蛋白表达的方法为:将培养后的阳性转化菌液接种到含Amp的LB液体培养基中,培养至OD600为0.5~0.8之间;然后加入IPTG诱导剂,在16℃~30℃下继续培养10h~24h;所述IPTG诱导剂的浓度为0.1mM~1mM。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S5步骤中所述纯化的具体包括以下步骤:

S5-1、将经过蛋白表达后的菌液置于冰上停止表达,然后离心收集菌体;

S5-2、在收集的菌体中加入裂解液于冰上裂解得到裂解后的菌体;

S5-3、将所述裂解后的菌体超声破碎、离心,收集离心后的上清液;

S5-4、将所述上清液倒入含镍柱的纯化柱中,使蛋白与镍柱结合;

S5-5、排出流出液,然后用洗涤液洗脱杂蛋白;

S5-6、加入目的蛋白洗脱液洗脱,得到鸽子磁敏蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,

所述S5-1步骤中,所述经过蛋白表达后的菌液置于冰上10min~20min,使其停止表达;然后于4℃、5000rpm~8000rpm条件下离心10min~20min,倒掉上清,收集菌体;

和/或,所述S5-2步骤中,在收集好的菌体中加入40mL~60mL配制好的裂解液,混匀,于冰上裂解30min~40min得到裂解后的菌体;

和/或,所述S5-3步骤中,将裂解后的菌体进行超声波破碎,超声时设置工作时间5s,休息10s,功率30,共超声10min;超声完成后,置于冰上使其冷却;然后将液体倒入离心管内,于4℃、10000rpm~15000rpm条件下离心50min~60min得到上清液和沉淀;

和/或,所述S5-4步骤中,将所述上清液倒入含镍柱的纯化柱中,将柱子置于4℃,避光条件下缓慢旋转10min~60min使蛋白与镍柱结合。

和/或,所述S5-5步骤中,所述洗涤液包括70mM~90mM的咪唑溶液;

和/或,所述S5-6步骤中,所述目的蛋白洗脱液包括250mM~500mM的咪唑溶液。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其特征在于,所述鸽子磁敏蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

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