本发明属于反相HPLC技术领域，尤其是涉及一种批量化产业化纯化鲑降钙素的方法。
背景技术：
鲑降钙素，英文名：Calcitonin salmon，分子式：C145H240NllO9S2, 分子量3431.85，其肽序如：H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser -Gly-Thr-Pro-NH2 。
醋酸鲑降钙素能够抑制破骨细胞的活性；抑制骨盐溶解，阻止骨内钙释出；改善骨密度，有效缓解疼痛症状；降低骨折的危险性和降低血钙。因此临床上主要用于治疗老年骨质疏松症，绝经后骨质疏松症，骨折移癌症高钙血症。
在已发表的文献中未发现工业化纯化工艺，因此摸索一条适于工业化生产醋酸鲑降钙素的方法很有必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产鲑降钙素的纯化方法，主要解决目前没有一条适于工业化生产纯化醋酸鲑降钙素的方法的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种纯化鲑降钙素的方法，包括如下步骤：
1）将鲑降钙素粗品溶液以滤膜过滤后，以C8或C18反相硅胶柱，流动相A相为体积百分比0.1%甲酸水溶液，B相为体积百分比0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱收集目标峰；
2) 利用HPLC转成醋酸盐；
3）将所得溶液减压旋蒸浓缩后冷冻干燥得到粉末状成品肽。
所述滤膜为孔径0.45μm滤膜。
所述梯度洗脱：B%：体积浓度梯度10-50%，30-50min，检测波长为205nm。
所述的HPLC转盐法：体积百分比0.3%的醋酸溶液和色谱纯乙腈的两相溶液，色谱柱为C8或C18反相硅胶柱。
本发明的有益效果是：本发明提出的一条适于产业化鲑降钙素的纯化工艺方法。鲑降钙素在氧化过程中产生新的杂质很难去除，本发明在HPLC法纯化过程中以乙腈作为有机溶剂流动相，并用HPLC转盐，不仅能得到HPLC纯度大于99.0%的精肽，而且可以有效降低生产过程中有机溶剂的毒性，降低成本，从而达到大规模工业化生产的目的。
附图说明
图1为鲑降钙素的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.样品处理
在鲑降钙素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后备用。
2. 纯化
纯化条件：色谱柱为C8反相硅胶柱，直径和长度为：5cm×25cm，流动相：A相：体积百分比0.1%甲酸水溶液；B相：体积百分比0.1%甲酸乙腈溶液。流速：60-80mL/min。检测波长：205nm。梯度：B%：体积浓度梯度10-50%，30-50min。进样量为2.5-4g。
纯化过程：用体积浓度10%的B相平衡色谱柱，上样量为0.5-1.5L样品溶液。线性梯度洗脱收集目标峰，将收集好的肽溶液放置备用。
3．转盐
用体积浓度60%以上的去离子水冲洗C18反相硅胶柱至流出液为中性，以体积百分比0.3%醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈溶液平衡色谱柱，上样已收集好的目标峰溶液。线性梯度洗脱：10-30min，体积浓度梯度90-95%的醋酸盐水溶液；30-90min，体积浓度梯度30-90%的乙腈溶液，收集全部的目标峰。
4．将收集的溶液进行减压浓缩至1g/50mL，浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的鲑降钙素，收率32.3%。产品色谱图见图1。
实施例2
1. 样品处理
在鲑降钙素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后备用。
2. 纯化
纯化条件：色谱柱为C18反相硅胶柱，直径和长度为：10cm×25cm，流动相：A相：体积百分比0.1%甲酸水溶液；B相：体积百分比0.1%甲酸乙腈溶液。流速：180-200mL/min。检测波长：205nm。梯度：B%：体积浓度梯度10-50%，30-50min。进样量为5-10g。
纯化过程：用体积浓度10%的B相平衡色谱柱，上样量为1.5-2.5L样品溶液。线性梯度洗脱收集目标峰，将收集好的肽溶液放置备用。
3．转盐
用体积浓度60%以上的去离子水冲洗C18反相硅胶柱至流出液为中性，以体积百分比0.3%醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈溶液平衡色谱柱，上样已收集好的目标峰溶液。线性梯度洗脱：10-30min，体积浓度梯度90-95%的醋酸盐水溶液；30-90min，体积浓度梯度30-90%的乙腈溶液，收集全部的目标峰。
4．将收集的溶液进行减压浓缩至1g/50mL，浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的鲑降钙素，收率31.6%。产品色谱图见图1。
实施例3
1. 样品处理
在鲑降钙素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后备用。
2. 纯化
纯化条件：色谱柱为C18反相硅胶柱，直径和长度为：15cm×25cm，流动相：A相：体积百分比0.1%甲酸水溶液；B相：体积百分比0.1%甲酸乙腈溶液。流速：280-300mL/min。检测波长：205nm。梯度：B%：体积浓度梯度10-50%，30-50min。进样量为12-18g。
纯化过程：用体积浓度10%的B相平衡色谱柱，上样量为2.0-3.0L样品溶液。线性梯度洗脱收集目标峰，将收集好的肽溶液放置备用。
3．转盐
用体积浓度60%以上的去离子水冲洗C18反相硅胶柱至流出液为中性，以体积百分比0.3%醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈溶液平衡色谱柱，上样已收集好的目标峰溶液。线性梯度洗脱：10-30min，体积浓度梯度90-95%的醋酸盐水溶液；30-90min，体积浓度梯度30-90%的乙腈溶液，收集全部的目标峰。
4．将收集的溶液进行减压浓缩至1g/50mL，浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的鲑降钙素，收率30.8%。产品色谱图见图1。