一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法与流程

技术特征：

1.一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：

步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：

提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：

根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re-ex-F和re-ex-R，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-Eakr；

步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：

将步骤(2)得到的重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；

以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS-PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；

步骤(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析：

将步骤(3)纯化的黄鳝pET-Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到黄鳝Eakr多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一对特异性引物为：

引物名称为AKR-F，如SEQ ID NO：3所示；

引物序列为5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’；

引物名称为oligod(T)，如SEQ ID NO：4所示；

引物序列为5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’。

3.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增时，PCR扩增的反应体系为，总体积为25μL时：

反应条件为：

4.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二对特异性引物为：

上游引物名称为re-ex-F如SEQ ID NO：7所示；

引物序列为：5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’；

下游引物名称为re-ex-R如SEQ ID NO：8所示；

引物序列为：5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’；

任选地，PCR扩增的反应体系为，总体积为25μL时：

反应条件为：

5.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，IPTG进行诱导时，IPTG的添加时间点为大肠杆菌BL21(DE3)进入指数生长期时，IPTG的终浓度为0.05mol/L，IPTG的诱导时间为3小时；所述裂解缓冲液组分为：6mol/L盐酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/L PBS。

6.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，黄鳝Eakr重组蛋白的分子量为37.7kDa。

7.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述免疫的免疫量为0.2mg。