人神经突起生长因子（Neuritin）多克隆抗体的制备方法及其应用与流程

本申请属于生物工程领域，具体地说，涉及一种Neuritin多克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术：

Neuritin(神经可塑性相关蛋白，又名CPG15)，是Nedivi等在海马齿状回中筛选可塑性相关基因过程中发现的一种对光线敏感，并且可以促进新皮质可塑性的新型神经营养因子，位于人类六号染色体6p24-p25之间，后由于Naeve等[Nedivi E,Hevroni D,Naot D,Israeli D,Citri Y.Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning[J].Nature.1993；363:718-722.]研究发现它的表达产物可以促进神经突起的快速生长而被命名为神经突起因子(Neuritin)。其开放阅读框为426bp，含有3个外显子，2个内含子，整个编码区共编码142个氨基酸，其中第1～27号氨基酸残基是信号肽，第28～115号氨基酸残基为Neuritin发挥生物学活性的中心部位，第116～142号氨基酸是GPI锚定位点。它在神经领域的功能已被多方证实可以促进神经突起生长、神经元分支和突触成熟、抑制神经元凋亡、调节突触回路形成、维持神经元存活等，并与神经系统可塑性密切相关。近年来也有研究表明Neuritin在抑郁症和阿兹海默症等神经系统疾病的治疗方面具有巨大的潜在价值。

随着研究的深入，Neuritin在神经领域的重要性正逐年被更深入地发现，同时多方面的研究表明，Neuritin的功能并非仅仅局限于神经领域。Naeve等通过Northern blot方法对多种人类组织中Neuritin的mRNA表达进行检测后发现，Neuritin在脑、肺、肝组织都有表达；此外，部分研究结果表示，骨骼肌及胃癌组织中也有Neuritin的表达，并且其在胃癌组织中的表达水平显著高于其癌旁组织。2007年David TomLinson 等人[Karamoysoyli E,Burnand RC,Tomlinson DR,Gardiner NJ.Neuritin mediates nerve growth factor-induced axonal regeneration and is deficient in experimental diabetic neuropathy[J].Diabetes.2008；57(1):181-189.]的研究表明Neuritin在STZ诱导的糖尿病大鼠体内表达含量下降，并认为Neuritin有可能是糖尿病的一个潜在治疗靶点。此外Le Jan等[Le Jan S,Le Meur N,Cazes A,Philippe J,Le Cunff M,et al.Characterization of the expression of the hypoxia-induced genes neuritin,TXNIP and IGFBP3 in cancer[J].FEBS Lett.2006；580:3395-3400.]的研究发现，其表达水平在缺氧环境中有所升高。Neuritin在促迁移、促分化、抑制细胞凋亡、促进血管生成等方面具有其独特作用。以上研究表明Neuritin未来可能会在神经领域、肿瘤以及糖尿病等疾病的治疗中发挥重要作用。

目前，市售Neuritin抗体的应用都有不同程度的局限性，如有些抗体只能识别Neuritin重组蛋白，而有些抗体只能识别细胞内源性蛋白；几乎没有抗体可以做免疫共沉淀及免疫荧光实验；且市售Neuritin抗体都为进口，货运周期长、价格昂贵、部分抗体特异性较差。以上对于科学研究形成了不便。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种Neuritin多克隆抗体的制备方法及其应用。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种Neuritin多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)制备抗原Neuritin蛋白冻干粉；

2)用抗原Neuritin蛋白免疫动物；

3)获取抗血清；

4)Neuritin多克隆抗体的纯化。

进一步地，步骤2)中的用抗原Neuritin蛋白免疫动物具体为：

以完全佐剂乳化的蛋白为免疫原免疫雄性壮年健康SD大鼠，方法为：皮下多点注射，2mL完全佐剂乳化的蛋白/只，每点注射体积0.2mL，共免疫4次，初次免疫后3天进行第二次免疫，第二次免疫后的第25天进行第三次免疫；在第三次加强免疫后的第3-5天，对小鼠进行尾部静脉取血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体效价；其中，完全佐剂乳化的蛋白通过以下方法制备得到：取1mL、浓度为1mg/mL的纯化后的抗原Neuritin蛋白与等体积的完全弗式佐剂混合，加入到冰浴的研钵中，充分研磨，取研磨的乳化液滴于水中观察不扩散，说明形成“油包水”，制备得到完全佐剂乳化的蛋白。

进一步地，步骤3)中的获取抗血清具体为：末次免疫后一周对大鼠进行心脏采血，大鼠在采血前一天禁食；将获取的血液立即注入灭菌的EP管中，置于37℃温箱大约1h，待血液凝固后，4℃，3000r/min离心15min，弃沉淀保留上清，即获得血清；取离心后的上清，加入质量浓度2％的叠氮钠，使终浓度为0.02％，分装后保存于-20℃—-80℃。

进一步地，步骤4)中的Neuritin多克隆抗体的制备具体为：

4.1)免疫亲和层析柱制备：用超滤法将6-10mg Neuritin蛋白液中的溶液替换为抗体纯化的Coupling Buffer，称取300mg CNBr-sepharose 4B介质，混悬于1mM HCl中，在垂熔玻璃滤器中洗15-30min；将准备好的Neuritin蛋白溶液和CNBr-sepharose 4B介质混合，室温1h/4℃过夜颠倒旋转；将偶联有蛋白的介质装柱；用至少5V的Coupling buffer清洗装好的亲和层析柱；用0.1M Tris-HCl buffer，pH 8.0的封闭液封闭介质2h；用至少5倍柱体积的Binding buffer清洗介质；用至少5倍柱体积的再生缓冲液一和再生缓冲液二分别对亲和层析柱进行清洗，共三个循环；清洗完毕将柱子保存于含有0.02％叠氮钠的1.0M NaCl溶液中，4℃冰箱储存待用；

4.2)抗体纯化：将抗血清10000rpm，4℃离心，上清按照Tris-HCl：血清＝1：10的比例加入pH8.0的0.1M Tris-HCl；逐滴加入饱和硫酸铵溶液，至30-50％饱和度，混悬1h；10000rpm，20min，4℃离心，上清再次加入饱和硫酸铵至30-50％饱和度，混悬1h，再次离心，10000rpm，20min，弃上清；将两次离心的沉淀用200μL PBS(pH7.4)重悬，收集抗体蛋白；将抗体溶液加入制备好的亲和层析柱中，慢速上下颠倒旋转，室温2h/4℃过夜；流出柱子中的液体，即“流出液”，用2-5倍体积的Binding buffer清洗柱材料；用洗脱液清洗柱子，直至洗脱液中蛋白浓度为零；收集抗体洗脱液，并立即向其中加入一定量的Binding buffer，中和其酸性环境；将获得的抗体蛋白超滤，使最终获得的纯化后抗体保存于PBS(pH7.4)溶液中，分装，-80℃储存；用至少5倍柱体积的Binding buffer清洗介质；分别用至少5倍柱体积的再生缓冲液一和再生缓冲液二对亲和层析柱进行清洗，共三个循环；清洗完毕将柱子保存于含有0.02％叠氮钠的1.0M NaCl溶液中，4℃冰箱储存待用。

进一步地，再生缓冲液一具体为：Tris-HCl 0.1M，NaCl 0.5M，pH 8.0。

进一步地，再生缓冲液二具体为：醋酸钠pH 4.0 0.1M，NaCl 0.5M。

本发明还公开了一种上述制备方法制备得到的Neuritin多克隆抗体。

进一步地，Neuritin多克隆抗体的浓度为0.84mg/mL。

进一步地，Neuritin多克隆抗体的效价为1：16000。

本发明还公开了一种上述的Neuritin多克隆抗体在免疫共沉淀中的应用。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1)与目前市售Neuritin抗体相比，本发明制备得到的Neuritin多克隆抗体的抗原是巴斯德毕赤酵母表达的抗原，纯度高于95％，产生的抗体特异性较好，杂带少；

2)使用neuritin(aa28-115)全序列作为抗原，易产生抗体且不额外引入其他非特异性抗体蛋白，识别范围广泛。经鉴定，纯化的抗体即可识别细胞内源性Neuritin；又可识别重组蛋白Neuritin；

3)本发明制备的Neuritin抗体增加了新用途，除了用于western blot、IF，是目前唯一一个可用于免疫共沉淀的鼠Neuritin抗体。因此，具有巨大的市场价值。

当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请抗Neuritin抗血清的免疫亲和层析纯化效果鉴定(SDS-PAGE)；其中，1代表抗血清，2代表抗血清流出液，3代表抗体洗脱液；

图2是本申请抗Neuritin抗血清的免疫亲和层析纯化效果鉴定；其中，A.Neuritin抗血清，B.纯化后抗血清(抗体洗脱液)，C.抗体流出液；各泳道样品名称：1.大肠杆菌Neuritin融合蛋白(25kD)，2.毕赤酵母Neuritin(10.98kD)盐析液，3.SH-SY5Y细胞提取液(16kD)，4.带His标签非Neuritin阴性对照蛋白(约28kD)；

图3是本申请Santa Cruz公司与抗体洗脱液对重组Neuritin蛋白的识别(Santa公司只识别重组Neuritin)；其中，A代表纯化后Neuritin抗体洗脱液，B代表Santa Cruz公司Neuritin单克隆抗体，A和B中：1代表大肠杆菌Neuritin(25kD)融合蛋白，2代表酵母Neuritin(10.98kD)重组蛋白，3代表SH-SY5Y细胞全蛋白提取液，4代表大肠杆菌带His的非Neuritin阴性对照蛋白(28kD)；

图4是本申请不同Neuritin抗体对细胞提取液中Neuritin蛋白的识别(Abcame公司只识别内源性Neuritin)，其中，A代表自制Neuritin抗血清，B代表抗血清流出液，C代表Abcam公司Neuritin多克隆抗体。样本：SH-SY5Y细胞提取液；

图5是本申请纯化后Neuritin抗体蛋白浓度测定；

图6是本申请自制Neuritin抗体在免疫荧光中的应用(SH-SY5Y细胞)；

图7是本申请不同Neuritin抗体在免疫沉淀中的应用，其中，抗体A代表自制Neuritin抗体，抗血清B代表Abcam公司Neuritin多克隆抗体，C代表Santa Cruz公司Neuritin单克隆抗体；

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1抗原Neuritin蛋白的制备及鉴定

1.1按照中国发明专利一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用(申请号：201510014771.0，申请日：2015.01.12，公开号：CN104774777A，公开日：2015-07-15)中的方法，将Neuritin毕赤酵母重组菌株经诱导表达、纯化、超滤除盐、鉴定等步骤，最终获得，纯度95％以上的抗原Neuritin蛋白。

1.2 Neuritin纯化蛋白的鉴定

1.2.1 Neuritin纯化蛋白浓度测定

按照Super bradford蛋白浓度试剂盒说明书中的要求，将BSA标准蛋白液进行不同浓度稀释，并使用酶标仪检测595nm波长处的OD值，建立标准曲线。根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

1.2.2 Neuritin纯化蛋白的蛋白银染

SDS-PAGE电泳完毕，按照康为世纪公司的Protein Silver Stain Kit(CW2012)试剂盒过程进行操作，具体操作见下。

(1)需提前配制溶液：

固定液50mL(超纯水：乙醇：冰醋酸＝6：3：1)；洗脱液50mL(10％乙醇)；终止液50mL(5％冰醋酸)；增敏工作液：25mL超纯水中加入50μL silver stain sensitizer(500×)；显影液：25mL silver staindeveloper加入30μL silver stain enhancer。以上溶液充分混匀后室温放置，现用现配。

(2)水洗：电泳完成后，取出凝胶，超纯水洗胶2次，每次5min。

(3)固定：用25mL固定液固定凝胶2次，每次15min。

(4)洗脱：固定完成后，用洗脱液洗胶2次，每次5min。

(5)水洗：用超纯水洗胶2次，每次5min。

(6)增敏：将洗好的凝胶置银染增敏工作液中，准确孵育1min。

(7)水洗：超纯水洗胶3次，每次20s。

(8)银染：弃去超纯水，将凝胶在银染工作液中孵育30min。

(9)水洗：用超纯水快速洗胶2次，准确控制清洗时间20s。

(10)显影：立即将洗好的凝胶浸没在显影液中，室温下孵育2-3min，直至蛋白条带显示清晰。注意：显影30s内，蛋白条带开始显现，继续显影1-3min至条带清晰。若蛋白条带显色较浅，可适当延长显影时间至5min及以上。

(11)终止：用终止洗去凝胶上的显影液后，将凝胶浸泡在新的终止液中，反应10min。

(12)将凝胶置于凝胶成像仪上拍照。

1.3纯化Neuritin蛋白冻干粉的制备

1)将冻干瓶洗净、烘干、冷却，置于-80℃冰箱冷冻约20min。

2)将需要冻干的样品平铺于冻干瓶中，所铺厚度尽量轻薄，继续置于-80℃冰箱冷冻，至少20min。

3)打开冻干机，使冻干机处于冻干状态。

4)迅速取出冷冻样品，开始冻干，冻干所需的时间视样品厚度而定。

5)冻干粉制备成功后，取出置于-80℃冰箱储存。

实施例2 Neuritin多克隆抗体的制备与纯化

2.1 Neuritin多克隆抗体的制备

2.1.1动物免疫

1)选取雄性壮年健康SD大鼠2只，在温度20-25℃、湿度40％-70％室内环境内饲养一周，期间定时按大约15g/只的用量投喂大鼠饲料，提供充足的饮用水，自然光照。

2)抗原乳化：取1mL纯化后的抗原Neuritin蛋白(1mg/mL)与等体积的完全弗式佐剂(FAC)混合，加入到冰浴的研钵中，充分研磨，取研磨的乳化液滴于水中观察不扩散，说明形成“油包水”，即可使用。

3)麻醉：按每只大鼠1-1.5mL/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛。

4)首次免疫：2mL完全佐剂乳化的蛋白，背部皮下分点注射，每点注射体积约0.2mL，免疫完毕的大鼠送回鼠笼，饲养方法同前。

5)首次免疫后的第3天，进行第二次免疫，方法同首次免疫，但免疫佐剂使用“弗氏不完全免疫佐剂(FAIC)替代“FAC”。

6)第二次免疫后的第25天进行第三次免疫，方法同第二次免疫。

7)第三次免疫后第3-5天，用1mL注射器耳缘静脉采血，分离血清，免疫结束即可进行采血步骤。

2.1.2抗血清的获取

1)末次免疫后一周进行心脏采血，大鼠在采血前一天禁食。

2)将大鼠麻醉后仰面固定于保定架上，采用心脏取血法获取全血血液样本：大鼠仰面，剪去心脏部位胸毛，碘酒消毒皮肤；用左拇指摸到胸骨剑突处，食指和中指放在右胸处轻轻向左推心脏，使心脏固定于左侧。然后触摸左侧心脏搏动最强的部位；用10mL注射器，倾针45°，对准心脏搏动最强处刺入心脏抽血。

3)将上一步获取的血液立即注入灭菌的EP管中，置于37℃温箱大约1h，待血液凝固后，4℃，3000r/min离心15min，弃沉淀保留上清，即获得血清。

4)取离心后的上清，加入质量浓度2％的叠氮钠(使终浓度为0.02％)，分装后保存于-20℃—-80℃(注：叠氮钠属于防腐剂，可不加)。

2.2 Neuritin多克隆抗体的纯化

2.2.1免疫亲和层析柱制备

1)用超滤法将6-10mg Neuritin蛋白液中的溶液替换为抗体纯化的Coupling Buffer。

2)称取300mg CNBr-sepharose 4B介质，混悬于1mM HCl中，在垂熔玻璃滤器中洗15-30min(1mL介质约需60mL 1mM HCl)。

3)将准备好的Neuritin蛋白溶液和CNBr-sepharose 4B介质混合，室温1h/4℃过夜颠倒旋转。

4)将偶联有蛋白的介质装柱，装柱过程注意不要有气泡。

5)用至少5V的Coupling buffer清洗装好的亲和层析柱。

6)用0.1M Tris-HCl buffer，pH 8.0的封闭液封闭介质2h。

7)用至少5倍柱体积的Binding buffer清洗介质。

8)用至少5倍柱体积的再生缓冲液一(Tris-HCl 0.1M，NaCl 0.5M，pH 8.0)和再生缓冲液二(醋酸钠pH 4.0 0.1M，NaCl 0.5M)分别对亲和层析柱进行清洗，共三个循环。

9)清洗完毕将柱子保存于含有0.02％叠氮钠的1.0M NaCl溶液中，4℃冰箱储存待用。

2.2.2抗体纯化

1)将抗血清10000rpm，4℃离心，上清按照体积比Tris-HCl：血清＝1：10的比例加入pH8.0的0.1M Tris-HCl。逐滴加入饱和硫酸铵溶液，至30-50％饱和度，混悬1h。

2)10000rpm，20min，4℃离心，上清再次加入饱和硫酸铵至30-50％饱和度，混悬1h，再次离心，10000rpm，20min，弃上清。

3)将两次离心的沉淀用200μL PBS(pH7.4)重悬，收集抗体蛋白。

4)用超滤的方法将抗体蛋白的溶液替换为Binding buffer，终体积2-3mL左右，用0.22/0.45μm滤器过滤。

5)将抗体溶液加入制备好的亲和层析柱中，慢速上下颠倒旋转，室温2h/4℃过夜。

6)流出柱子中的液体，即“流出液”，用2-5倍体积的Binding buffer清洗柱材料。

7)用洗脱液清洗柱子，直至洗脱液中蛋白浓度为零。收集抗体洗脱液，并立即向其中加入一定量的Binding buffer，中和其酸性环境。

8)将获得的抗体蛋白超滤，使最终获得的纯化后抗体保存于PBS(pH7.4)溶液中，分装，-80℃储存。

9)用至少5倍柱体积的Binding buffer清洗介质。

10)分别用至少5倍柱体积的再生缓冲液一(同上)和再生缓冲液二(同上)对亲和层析柱进行清洗，共三个循环。

11)清洗完毕将柱子保存于含有0.02％叠氮钠的1.0M NaCl溶液中，4℃冰箱储存待用。

实施例3 Neuritin多克隆抗体的鉴定与应用

3.1 Neuritin多克隆抗体的鉴定

3.1.1 SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定

制12％的SDS-PAGE凝胶，电泳，方法同1.3.1。结果见图1，如图1所示，纯化后抗体在25kD和55kD处出现抗体轻链与重链条带，且较抗血清的纯度有明显提高。

3.1.2 Western blot检测抗体特异性

将待检抗体作为一抗，对不同样本中的Neuritin蛋白情况进行检测，详细方法同1.3.2，结果见图2-图4。

分别对抗血清、纯化后抗体(即抗体洗脱液)以及抗体流出液的特性进行鉴定。使用不同一抗对完全一致的四个样本进行Western Blot鉴定。如图2所示，抗Neuritin抗血清可以识别25kD处大肠杆菌与10.98kD处酵母表达系统的重组Neuritin蛋白以及16kD处的细胞内源性Neuritin蛋白，抗体洗脱液可以识别重组Neuritin蛋白，抗体流出液可以识别细胞内源性Neuritin蛋白。

分别对抗血清、纯化后抗体(即抗体洗脱液)以及抗体流出液的特性进行鉴定。使用不同一抗对完全一致的四个样本进行Western Blot鉴定。如图3所示，抗Neuritin抗血清可以识别25kD处大肠杆菌与10.98kD处酵母表达系统的重组Neuritin蛋白以及16KD处的细胞内源性Neuritin蛋白，抗体洗脱液可以识别重组Neuritin蛋白，抗体流出液可以识别细胞内源性Neuritin蛋白。

分别使用不同抗体对细胞提取液进行了Western Blot检测，以评价自行制备抗体的免疫效果。如图4所示，自制Neuritin抗血清、抗体流出液以及Abcam公司Neuritin多克隆抗体都可以识别内源性Neuritin蛋白(16kD)，其中自制Neuritin抗血清、抗体流出液相对Abcam公司Neuritin多克隆抗体Neuritin蛋白条带清晰且非特异性条带较少。

3.1.3 BCA法检测抗体蛋白浓度

按照BCA蛋白浓度试剂盒说明书中的要求，将2mg/mL BSA溶液行不同浓度的稀释，并使用酶标仪检测562nm波长处的吸收值，建立标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。如图5所示，本次纯化后抗体的蛋白浓度为0.84mg/mL。

3.1.4间接ELISA法检测抗体效价

1)抗原包被：将抗原使用包被液，按所需浓度稀释，加入96孔板(100ul/孔)，4℃冰箱过夜孵育。

2)封闭：弃去包被液，使用洗涤液洗涤3次后，加入封闭液(100ul/孔)，室温放置0.5h。

3)清洗：弃去封闭液，使用洗涤液洗涤3次。

4)加待测样品(一抗)：使用稀释液将待测抗体按照1：1000、1：2000、1：4000等倍数稀释，100μL/孔加到已包被的板上，加盖37℃恒温箱水浴1.5-2h。

5)清洗：弃去一抗液，使用洗涤液洗涤3次；

6)加酶标第二抗体：用封闭液将兔抗鼠/山羊抗兔IgG-HRP二抗液按1：5000稀释后按100μL/孔加入板内，加盖37℃恒温箱温育1.5h。

7)清洗：弃去二抗液，使用洗涤液洗涤5次以上。

8)显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。

9)终止显色：加50μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。

将抗血清按照稀释液1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的比例进行稀释后分别加入包被有抗原Neuritin蛋白的96孔板内，TMB显色后检测OD450，以OD450大于阴性对照组2.1倍的结果为阳性，否则为阴性，判断为阳性的最大稀释比即为抗体效价。使用酶标仪检测各组在450nm处的读值情况，抗体效价为1：16000，结果见表1。

表1使用酶标仪检测各组在450nm处的读值情况

3.2 Neuritin多克隆抗体的应用

3.2.1免疫荧光(Immunofluorescence，IF)

3.2.1.1细胞复苏

1)无菌操作台等紫外消毒30min，37℃水浴锅中预热培养用液。操作前，用75％酒精对双手和超净工作台进行消毒。

2)从液氮罐中迅速取出装有SH-SY5Y细胞株的冻存管，放入水浴箱，摇动使之在2min内融化。

3)酒精擦拭冻存管后，迅速将融化的悬液加入离心管中，800rpm，离心3min，弃上清，收集沉淀。

4)向细胞中加入含10％FBS的DMEM培养基1mL，轻轻吹打8-10次，使细胞分散成为单个细胞。

5)将细胞悬液加入无菌培养皿中，再加入相应的DMEM培养基(含10％FBS)，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。

6)24h后观察细胞状态及其贴壁情况，并更换新鲜培养基。

3.2.1.2细胞冻存

1)冻存前一天更换细胞培养基，观察细胞形态。

2)配置冻存液，DMSO:FBS＝1:9或DMSO:DMEM:FBS＝1:4:5，混合均匀，置于室温下待用。

3)将贴壁率95％以上，状态良好的细胞弃去旧培养液，PBS洗细胞2次。

4)加入200μL 0.25％胰蛋白酶，室温下消化2min，加入1mL DMEM培养液终止细胞消化，放入离心机，离心3min(800rpm)，弃上清。

5)取1mL冻存液缓缓加入离心管，吹打重悬细胞7～10次，分装于预冷的冻存管内1mL/管。

6)冻存方法：将冻存管冻存盒(含250mL异丙醇)中，-80℃冰箱冻存48h后，转入液氮中保存。

3.2.1.3细胞传代

1)无菌操作台紫外消毒30min，37℃水浴锅中预热PBS与培养基。操作前，用75％酒精对双手和超净工作台进行消毒。

2)选择贴壁率大于90％，状态良好的SH-SY5Y细胞，小心弃去旧培养液，用PBS清洗细胞2次。

3)加入200μL 0.25％胰酶液，室温下消化2-3min，加入1mL含10％FBS的DMEM培养基终止消化，800rpm离心5min，小心吸弃上清。

4)用1mL含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，轻轻吹打6-8次，使之成为单细胞悬液。

5)在新的培养瓶或培养皿内，根据需要按比例接种细胞，将细胞置于5％CO2培养箱内，37℃过夜培养。

6)24h后在显微镜下观察细胞贴壁情况及细胞状态。

3.2.1.4免疫荧光实验

1)将干净的细胞爬片放入75％酒精中，浸泡至少2h后取出晾干，放入含有0.1％多聚赖氨酸培养皿中，在37℃，5％CO₂培养箱中过夜，注意避光。

2)将多聚赖氨酸包被的爬片取出，用过滤ddH₂O清洗2次。自然晾干后，放入6孔板中备用。

3)紫外消毒无菌操作台30min，预热10％DMEM培养基和PBS。操作前，用75％酒精擦拭双手、操作台及常规用品。

4)将第3代状态良好，密度约40％的SH-SY5Y细胞接种至6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

5)培养约24h后，将细胞状态良好，贴壁40％左右的SH-SY5Y从培养箱取出，弃去陈旧培养基，用PBS清洗，1min×2次。

6)加入4％多聚甲醛1mL/孔，在4℃冰箱中固定30min。

7)将6孔板取出，弃去4％多聚甲醛，用PBS清洗，1min×2次。

8)加入1mL/孔10％山羊血清(以山羊血清：PBS＝1：9配制)，室温封闭30min。

9)用针头和镊子将爬片挑出，放在干净的载玻片上，做好标记。用吸水纸吸取载玻片上多余的水分。

10)取150μL一抗(Neuritin抗体1:50)，滴于细胞爬片上，37℃孵育2h。

11)PBS清洗细胞3min×3次，用吸水纸吸取多余的PBS。

12)加入150μL荧光二抗(罗丹明标记抗体1:100)，37℃避光孵育1.5-2h。

13)PBS清洗细胞3min×3次，用吸水纸吸取多余的PBS。

14)加入150μL荧光二抗(FITC记抗体1:100)，37℃避光孵育1.5-2h。

15)取出新的载玻片，甘油封片，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

分别使用自制抗Neuritin抗血清以及抗体流出液为第一抗体识别Neuritin蛋白(红)时，如图6所示，可以观察到，Neuritin蛋白在细胞膜上散在分布，且其免疫荧光结果与细胞膜上脂筏标记物Flotillion1(绿)具有一定共定位效应。

3.2.2免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)

1)取培养有SH-SY5Y细胞的培养皿，吸弃旧培养基，用预冷的PBS洗细胞3次。

2)吸弃PBS，向每个皿(直径60mm)中加入200μL预冷的细胞裂解液(PMSF:细胞裂解液＝1:100)，冰上放置15min，期间不定期摇匀。

3)轻轻用细胞刮刀将细胞刮至培养皿一侧，将细胞碎片和裂解液收集加入洁净离心管。

4)4℃冰箱慢速上下旋转裂解30min。

5)12000rpm，4℃离心10min，收集上清置于新的离心管中，进行蛋白浓度测定。

6)蛋白浓度测定：10μL蛋白样品+4mL考马斯亮蓝G250测定液，充分混匀，室温放置5min后595nm处测OD值。以ddH2O代替蛋白样品作为空白组进行调零。

7)将BSA标准液按照等比稀释至不同浓度，并测OD595值，根据浓度与OD值关系绘制标准曲线，将待测样品OD值带入标准曲线方程，计算出待测组蛋白浓度。

8)以最小浓度组的蛋白浓度为基线，对各组的蛋白浓度剂型配平，加入4×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5-10min，-20℃冰箱备用。

9)在上一步中，部分蛋白液配平浓度之后，加入1％BSA溶液，充分混匀。每管中加入2μL第一抗体，50rpm，常温孵育4h或者4℃孵育过夜。

10)Protein A/G agarose准备工作：Protein A/G Agarose加入1mL不含SDS的细胞裂解液，混匀，14000rpm，离心1min，小心吸弃上清，反复清洗3-4次，最后加入30μL不含SDS的细胞裂解液，轻轻混匀。

11)将同抗体孵育过夜的蛋白液取出，加入分装好的装有30μL Protein G agarose中，4℃温和振荡孵育2h。

12)14000rpm，4℃，离心30s，弃上清，加入1mL预冷的细胞裂解液(no SDS)，小心重悬beads悬珠，4℃温和振荡孵育15min。

13)重复上一步2次。

14)14000rpm离心30s，4℃，用1mL预冷的细胞裂解液(With SDS)小心重悬beads悬珠，4℃摇床温和孵育5min。

15)14000rpm离心30s，4℃，小心弃上清，注意不要吸出beads悬珠。

16)在沉淀的beads悬珠介质中加入含SDS细胞裂解液20μL，再加入15μL的4×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，重悬beads悬珠，放入加热模块，煮沸5-10min(100℃)，-20℃备用。

分别使用自制Neuritin抗体(A)、Abcam公司的Neuritin抗体(B)以及Santa Cruz公司的Neuritin单克隆抗体(C)进行了免疫沉淀实验，观察其在免疫沉淀实验中的应用情况。由图7可知，IP实验结果呈阳性，表明此次制备的Neuritin抗血清，可以应用于IP实验。

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。