快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法与应用与流程

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法与应用。
背景技术：
：单克隆抗体(monoclonalantibodies,mAbs)无疑是最具潜力的一类用于治疗及诊断的生物制剂，目前单克隆抗体已经有应用于肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的诊断及治疗。随着单克隆抗体的应用越来越广泛，单克隆抗体的制备技术也得到的迅速发展。陈惠发表了一篇题目为“用小鼠杂交瘤技术生产麻疹病毒抗体”的论文，该论文将BALB/e小鼠骨髓瘤p3x63Ags细胞与同系小鼠经vero细胞传代的麻疹病毒LEC株免疫的脾细胞在PEG作用下杂交。杂交细胞分种微量培养盘的孔内，进行孵育，用HAT培养液筛选单克隆细胞，用RIA检测，单克隆细胞孔中60帕麻疹抗体阳性。但是，上述采用的鼠来源的抗体用于人类疾病的治疗会有出现针对外源蛋白的有害免疫反应的风险。为克服鼠源抗体的不足，人杂交瘤技术及EBV转染的人永生化B细胞技术应运而生。顾若兰发表了一篇题目为“用杂交瘤技术建立永生化肝细胞研究药物代谢”的论文，该论文利用杂交瘤技术将原代肝细胞与不同亲本瘤细胞株融合，建立符合药物代谢研究要求、具备良好药物代谢酶活性的肝杂交瘤细胞株，并对其生物学特性及功能进行鉴定；评价肝杂交瘤细胞株在体外药物代谢研究中的应用价值。但这些技术方法存在高选择、低融合及转染效率低的缺陷，不适合大的抗体库的筛选如从成千上万的记忆细胞中分离特异性抗体。寨卡病毒可引起新生儿小头症及成人的Guillain-Barre综合症而受到世界的关注。目前针对寨卡病尚无有效的疫苗及治疗方法。单个B细胞抗体技术(singleBcellantibodytechnologies)，即从单个B细胞分离及克隆免疫球蛋白编码基因，维持了原始B细胞中抗体的重链及轻链配对。目前常用的针对病毒感染的全人单抗的分离主要采用荧光标记的抗原筛选感染者IgG+的记忆细胞，进行单细胞克隆。如在HIV感染者用荧光标记的gp140成功分离到与重组三聚体gp140抗原反应的IgG+的记忆细胞。这种方法一般是选择恢复期病人的外周血单个核细胞中的记忆细胞，只能筛选已知抗原，但会丢失一些不与重组抗原蛋白结合，但具有中和病毒等作用的重要的功能抗体，不利于该方法的大规模推广和应用。因此，研究和发开出可以预防及治疗寨卡病毒的方法是目前亟需解决的难题。技术实现要素：为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法与应用，以解决上述的问题。本发明提供了一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法，包括以下步骤：S1外周血单个核细胞分离：取寨卡感染者急性期外周静脉EDTA抗凝血，利用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞，分装2-4×106/管，置于液氮中冻存；S2浆细胞分离：将步骤S1冻存的外周血单个核细胞放置于37℃水浴中溶化，用PBS缓冲液洗涤3-4次，接着加入荧光标记抗体进行染色，室温避光孵育12-16min，使用PBS缓冲液洗涤后，加入300-500μlPBS缓冲液悬浮细胞上流式仪，分选出单个浆细胞于96孔PCR板中冻存；所述抗体为IgD、CD19、CD27、CD38、IgM和CD45，所述标记的荧光为FITC、ECD、PC7、APCA750、PB和KO；S3抗体可变区基因的PCR扩增和抗体的克隆：利用PCR方法从步骤S2得到的单个浆细胞中扩增抗体可变区基因，具体步骤如下：反转录合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入随机引物和反转录酶等，涡旋混匀，反应加热后置于冰上，反转录得到cDNA；PCR扩增抗体基因：配制PCR体系，经过预变性、变性、退火、延伸循环，PCR扩增抗体可变区基因.PCR产物经凝胶电泳鉴定，对阳性的基因片段进行测序分析.将从同一样品孔中筛选得到的一对重链、轻链可变区基因分别连接到载体上构建抗体表达质粒；S4共转染及鉴定：将步骤S3构建的抗体表达质粒采用96孔板瞬时转染293T细胞，细胞培养2-3天后收取培养上清用于ELISA鉴定。进一步地，所述步骤S2中抗体与标记荧光的配对为：IgD-FITC、CD19-ECD、CD27-PC7、CD38-APCA750、IgM-PB和CD45-KO。进一步地，所述步骤S2的流式分析中在IgM和IgD双阴的B细胞群体里定义CD27++-++CD138++群体为浆细胞。进一步地，所述步骤S3中PCR扩增中的聚合酶为Phusion超保真DNA聚合酶。进一步地，所述步骤S3中PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃30s；阶段2：循环17次，98℃10s，60-68℃30s,68℃30s；阶段3：循环13次，98℃10s，68℃30s,72℃30s；阶段4：72℃5min；在4℃保温。进一步地，所述步骤S4转染时的转染试剂为转染试剂Lipofectamine2000。进一步地，所述步骤S4转染时转染试剂的添加量与抗体表达质粒的体积比为3:1。另外，本发明还提供了所述的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法制备的寨卡病毒特异全人源单克隆抗体在预防或治疗寨卡病毒病的药物或诊断试剂中的应用。本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法是采用单个B细胞抗体技术从病毒感染急性期浆细胞中获得抗体,进一步对抗体进行评估，避免了只能筛选与已知抗原结合的抗体，丢失一些不与重组抗原蛋白结合且功能重要的抗体，大大的提高了筛选的效率和节约了时间。本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法简单快捷，不需要标记的抗原，仅需要相对较少的B细胞，而且可分离在体内存在而在体外很难效仿的构象结构域的功能性抗体，获得的特异性抗体对寨卡疫苗的研制有重要的指导意义，而且有些抗体可能具有临床治疗的应用前景。总之，本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法，与现有技术相比具有如下优势：(1)本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法不需要标记的抗原，操作简单；(2)本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法可以分离针对在体内存在而在体外很难效仿的构象结构域的功能性抗体，大大的提高了筛选的效率。附图说明图1为样品管上机分析的设门程序图；图2为抗体的重链及轻链可变区PCR产物经酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)的凝胶电泳图,其中：VH，VK和VL的凝胶电泳图的横向泳道分别标志均为：1-1，1-2，2-1,2-2,3-1,3-2,4-1,4-2，M2K，M5K，5-1,5-2,6-1,6-2,7-1,7-2,8-1,8-2；图3为抗体的重链及轻链可变区PCR产物经酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)与相应的载体连接构建抗体表达质粒图；图4为抗体克隆流程图。具体实施方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。实施例1、一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法S1外周血单个核细胞分离：取寨卡感染者急性期外周静脉EDTA抗凝血，利用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞，分装5×106/管，置于液氮中冻存；S2浆细胞分离：将步骤S1冻存的外周血单个核细胞放置于37℃水浴中溶化，用PBS缓冲液洗涤3次，接着加入荧光标记抗体进行染色，室温避光孵育15min，使用PBS缓冲液洗涤后，加入400μlPBS缓冲液悬浮细胞上流式仪，分选出单个浆细胞于96孔PCR板中冻存；所述抗体为IgD、CD19、CD27、CD38、IgM和CD45，所述标记的荧光为FITC、ECD、PC7、APCA750、PB和KO；S3抗体可变区基因的PCR扩增和抗体的克隆：利用PCR方法从步骤S2得到的单个浆细胞中扩增抗体可变区基因，具体步骤如下：反转录合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入随机引物和反转录酶等，涡旋混匀，反应加热后置于冰上，反转录得到cDNA；PCR扩增抗体基因：配制PCR体系，经过预变性、变性、退火、延伸循环，PCR扩增抗体可变区基因.PCR产物经凝胶电泳鉴定，对阳性的基因片段进行测序分析.将从同一样品孔中筛选得到的一对重链、轻链可变区基因分别连接到载体上构建抗体表达质粒；S4共转染及鉴定：将步骤S3构建的抗体表达质粒采用96孔板瞬时转染293T细胞，细胞培养2-3天后收取培养上清用于ELISA鉴定。实施例2、一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的具体操作步骤S1外周血单个核细胞分离：取寨卡感染者急性期外周静脉EDTA抗凝血，利用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞，分装5×106/管，置于液氮中冻存。S2浆细胞分离：将步骤S1冻存的外周血单个核细胞放置于37℃中水浴溶化，使用PBS缓冲液洗涤3次，接着加入抗体进行染色，室温避光孵育15min，使用PBS缓冲液洗涤后，加入400μlPBS缓冲液悬浮细胞上流式仪，所述流式仪为贝克曼库尔特MoFloAstriosEQ超高速流式细胞分选系统，荧光标记的抗体染色：设9个分析管，如表1，1-7管加入相应的单个荧光标记的抗体，第9管加入7种混合的荧光标记的抗体，第8管为只有细胞的空白管，表1荧光标记的抗体染色管号染色管设置抗体及标记的荧光体积(μl)荧光通道1单染IgD-FITC10FL12单染CD19-ECD5FL33单染7-AAD10FL44单染CD27-PC75FL55单染CD38-APCA7502FL86单染IgM-PB5FL97单染CD45-KO5FL108空白管不加抗体--9样品管7种抗体混合液--单个浆细胞分选：样品管上机分析，依据图1设门。依据7-AAD及CD45圈出活的CD45阳性的白细胞。依据CD19圈出B细胞。在IgM和IgD双阴的B细胞群体里定义CD27++-++CD138++群体为浆细胞。将单个浆细胞分选入96孔PCR板中。S3抗体可变区基因的PCR扩增和抗体的克隆：利用PCR方法从步骤S2得到的单个浆细胞中扩增可变区基因，具体步骤如下：反转录合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入随机引物和反转录酶等，涡旋混匀，反应加热后置于冰上，反转录得到cDNA，所述cDNA合成为试剂盒(SuperScriptIIIFirstStrandSynthesisSystem,invitrogen,#18080051)。PCR扩增抗体基因：配制PCR体系，经过预变性、变性、退火、延伸循环，PCR扩增抗体可变区基因，PCR产物经凝胶电泳鉴定，对阳性的基因片段进行测序分析.将从同一样品孔中筛选得到的一对重链、轻链可变区基因分别连接到载体上构建抗体表达质粒；PCR引物序列参考文献(JImmunolMethods.2008Jan1；329(1-2):112-24.)，经2轮PCR扩增抗体的重链(VH)及轻链可变区(VK/VL)。反应使用Phusion超保真DNA聚合酶(PhusionHigh-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer,NEB,#M0532s)。反应体系及循环条件如下表2：表2反应体系及循环条件成分体积(μl)2XPhusionmasterGCBuffer12.55′引物混合物(10um)13′引物混合物(10um)1H2O至25模板1-2所述PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃30s；阶段2：循环17次，98℃10s，60-68℃30s，68℃30s；阶段3：循环13次，98℃10s，68℃30s,72℃30s；阶段4：72℃5min；在4℃保温。所述PCR产物利用凝胶电泳图如图2所示。所述抗体的重链及轻链可变区PCR产物经酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)与相应的载体连接构建抗体表达质粒如图3所示。经序列分析确认。从寨卡病人分离到4个与病毒E蛋白结合的单抗，其等位基因使用见表3。表3抗体重链及轻链的等位基因命名V基因D基因J基因LJF-8-4VHIGHV4-39*02FHD4-11*01HJ5*01FVKKV1-9*01FKJ3*01FLJF-5-2VHIGHV3-23*01FIGHD3-22*01FIGHJ4*02FVKIGKV1-12*01FIGKJ1*01FZHJ-6-6VHIGHV4-59*01FIGHD1-26*01FIGHJ1*01FVKIGKV1-39*01FIGKJ2*01FZHJ-8-5VHIGHV5-51*01FIGHD2-15*01FIGHJ6*02FVKIGKV3-20*01FIGKJ1*01F抗体的重链及轻链可变区序列如下表4所示：表4抗体的重链及轻链可变区序列S4共转染及鉴定：将步骤S3构建抗体表达质粒采用96孔板瞬时转染293T细胞，细胞培养2-3天后收取培养上清用于ELISA鉴定。抗体的表达：采用96孔板瞬时转染293T细胞。每孔VH和VK质粒各0.125μg,转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)按1:3比例。细胞培养2-3天后收取培养上清用于ELISA。ELISA鉴定：同时检测IgG及与病毒E蛋白结合。ELISA板首先包被上kappa和lamda抗体或包被寨卡病毒E蛋白。加入10倍或1：1稀释的培养上清。2抗采用HRP标记的抗人IgG。底物显色终止后，读取450nmOD。检测结果如表5和表6所示。表5LJF-8-4和LJF-5-2的OD值命名IgGOD值E蛋白OD值LJF-8-43.58673.05643.40643.0674LJF-5-23.3823.57853.23943.4914阳性对照3.08362.32923.33282.3275阴性对照0.05580.25860.05370.2278表6ZHJ-6-6和ZHJ-8-5的OD值命名IgGOD值E蛋白OD值ZHJ-6-61.85580.21391.89740.2078ZHJ-8-52.10060.21272.21530.2051阳性对照1.86341.02071.83471.0104阴性对照0.04540.12510.4380.1154所述抗体克隆流程如图4。当前第1页1 2 3