专利名称：用酵母分泌表达重组人神经生长因子的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物的制备工艺。
人神经生长因子(human nerve growth factor，简称hNGF)是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。
hNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤，周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。rhNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhNGF)是唯一的选择。
由于hNGF分子包含3对二硫键，若用大肠杆菌进行表达须经过变性和复性步骤，复性率很低，纯化困难，成本居高不下，其产量和应用受到限制。为了提高hNGF的表达产率，我们用甲醇营养型的毕赤酵母来分泌表达重组hNGF。
本发明的原理毕赤酵母可以高效地表达酵母表达质粒上的外源基因并将表达的外源蛋白分泌至细胞壁外的培养基中。这样的表达产物具天然蛋白结构和生物学活性。
本发明的目的使用毕赤酵母高效表达hNGF并使表达产物分泌至培养基中，以产生结构正确、活性高的重组hNGF产品，提高产率，降低生产成本。
技术方案当然，亦可依不同方法来制备hNGF，如可在细菌或昆虫细胞及动物细胞等较高等真核细胞中表达。但最好是在酵母系统中表达，例如使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorphis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或最好是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌hNGF，而且还因为它在实际上是呈准确折迭形式的并具有高度活性的。
该体系以醇氧化酶(AOX1)为启动子，通过同源双交换使外源基因稳定地整合于酵母染色体，有效的避免了外源基因丢失。毕赤巴斯德酵母不但能使表达产物糖基化，避免酿酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可将表达产物分泌于胞外，而且自身蛋白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化设备。综上所述，酵母培养体系经济、简便，高密度发酵可得100克/L干重酵母，比较适合于大规模工业化生产。目前，尚未见有hNGF分子在酵母表达体系分泌表达的报道。
优选采用的酵母载体是所谓的穿梭载体，其具有的细菌质粒和酵母质粒的复制原点，以及在两种宿主系统中分泌的基因。此外，该类型载体还含有表达外来基因所必需的启动子顺序，以及最好有可改善产率的终止顺序，从而即可使利于同分泌信号融合的异源基因定位于启动子和终止密码子之间。
具体工艺简述如下hNGF基因的PCR扩增→表达质粒构建→转化毕赤酵母→高密度发酵表达→上清液分离→超滤浓缩→阳离子交换层析纯化→脱盐→除菌过滤→制剂分装→成品冻干。经上述步骤，即可制备得到纯度大于99％，生物比活性高于105U/mg蛋白的重组hNGF。
实施例1首先用PCR扩增的方法获得hNGF的全长基因。经DNA序列测定证实其序列正确后，插入我们已改建过的酵母表达质粒pPIC9K-Y。所构建成的表达质粒经DNA序列测定分析正确后，用SalI酶切成线性质粒，用电穿孔的方法转化入毕赤酵母，经过筛选即得到hNGF的高表达酵母工程菌。该工程菌在酵母培养基中生长、诱导、分泌，再将发酵液离心后，取上清液，超滤至十分之一体积，经脱盐后，过CM-Sepharose阳离子交换层析柱纯化，即得到纯度＞99％，比活性高于105U/mg的hNGF纯品。
实施例2表达用得自实施例1基本培养之新鲜过夜培养物的细胞接种10ml酵母完全培养基，以这种方式达到最适密度OD600＝0.1。于28℃振荡培养8小时，然后加入90ml新鲜培养基。再振荡培养20小时。离心分离细胞后，检测上清液中的hNGF活性。
本发明的优点本发明提供了一种用酵母分泌表达具天然蛋白结构和生物活性的hNGF的新型工艺方法。它与传统的大肠杆菌表达体系相比具有以下优点①表达产率高②产物具天然结构和生物活性，无需变性和复性③培养基简单、价廉④热源性物质减少。因此，产率显著提高，生产成本大幅度降低。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，产率提高，成本降低，更适合于工业化生产重组hNGF。
权利要求
1.用酵母分泌表达重组人神经生长因子。其特征在于表达用宿主细胞为毕赤酵母。
2.如权利要求1所述的重组人神经生长因子表达工程酵母的构建。其特征在于人神经生长因子基因插入酵母表达载体如pPIC，将此表达质粒转化毕赤酵母，即构建成重组人神经生长因子表达工程酵母。
3.如权利要求1所述的重组人神经生长因子的分泌表达。其特征在于重组人神经生长因子在酵母中表达后可以有效地分泌至培养基中，并且表达产物具天然蛋白结构和生物学活性。
4.重组人神经生长因子的分离和纯化。其特征在于经过培养液分离、超滤浓缩、阳离子交换层析等步骤，获得高纯度、高比活的重组人神经生长因子。
全文摘要
本发明公开了一种用毕赤酵母分泌表达重组人神经生长因子的新型工艺方法。将重组人神经生长因子基因插入酵母表达质粒中，转化毕赤酵母后经筛选得到高表达酵母工程菌，再经过表达和一系列纯化步骤，可以制备得到高纯度、高比活性的重组人神经生长因子。
文档编号C07K14/48GK1410539SQ0213579
公开日2003年4月16日 申请日期2002年11月15日 优先权日2002年11月15日
发明者王革 申请人:王革