专利名称：与胶原特异结合的神经生长因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经生长因子及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有与胶原特异结合能力的神经生长因子及其编码基因与该神经生长因子的表达方法。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growtla Factor，NGF)是一种由α，β，γ三种不同亚基组成的复合物，分子量约为140Kd。研究表明，NGF的β亚基(β-NGF)是一种同型二聚体分子，其单链含有118个氨基酸残基(Greene，L.A.and E.M.Shooter，Thenerve growth factorbiochemistry，syn thesis，and mechanism of action.AnnuRev Neurosci，1980.3p.353-402.)，它是NGF的功能亚基，与神经元的存活、迁移、生长、分化及与其它细胞建立功能性联系等诸多方面密切相关，具有神经营养和促神经突起的双重作用，是神经系统中最重要的生物活性物质之一，此外在防止失神经支配肌肉萎缩方面也起到重要作用(Sofroniew，M.V.，C.L.Howe，and W.C.Mobley，Nerve growth factor signaling，neuroprotection，and neural repair.Annu Rev Neurosci，2001.24p.1217-81.)。
临床应用证实，局部用药可以使神经直接得到营养，有利于神经的轴浆流动，促进神经再生。目前用神经营养因子治疗周围神经损伤的用药方式主要有(1)在损伤局部直接给药；(2)局部通过微渗透泵缓慢释放给药；(3)通过转基因技术将表达神经营养因子的细胞移植到损伤局部。通过直接给药的方式将外源性β-NGF应用到体内，受影响的因素较多，其活性的维持及作用效果与使用途径、方式、剂量等均有关系，一次性给药难以保证药物的持续作用，连续给药需要的药量又很大，治疗费用非常昂贵，并且由于大量地使用NGF，安全性很值得担忧；微渗透泵存在有排斥反应和体内吸收难的问题；基因治疗的载体选择和安全性问题较难解决，因此，以上给药方法都难以在临床推广应用。
胶原是神经元细胞外基质的主要成分之一，它与其它细胞外基质共同构成了神经元生长的空间支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有与胶原特异结合能力的神经生长因子。
本发明所提供的具有与胶原特异结合能力的神经生长因子，是在神经生长因子β亚基(β-NGF)的氨基端(N端)融合胶原结合结构域(collagen binding domain，CBD)得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。
序列表中的SEQ ID №1由7个氨基酸残基组成。
此外，为方便纯化，所述具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的氨基端还可连接有由6个组氨酸组成的组氨酸亲和标签序列。
其中，在β-NGF的N端融合胶原结合结构域得到的具有与胶原特异结合能力的神经生长因子可具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №2由159个氨基酸残基组成，自氨基端第5-10位氨基酸残基为组氨酸亲和标签序列；自氨基端第22-28位氨基酸残基为胶原结合结构域的保守序列，自氨基端第42-159位氨基酸残基为β-NGF，自氨基端第29-41位氨基酸残基为连接肽序列。
编码所述具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的基因，可为序列表中的SEQID №3。
序列表中的SEQ ID №3由480个碱基组成，自5’端第16-33位碱基编码组氨酸亲和标签序列，自5’端第67-87位碱基编码胶原结合结构域的保守序列，自5’端第127-480位碱基编码β-NGF，自5’端第88-126位碱基编码连接肽序列。
本发明的第二个目的是提供一种上述具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的表达方法。
本发明所提供的具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的表达方法，是构建含有具有与胶原特异结合能力的神经生长因子基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使具有与胶原特异结合能力的神经生长因子基因表达。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等，优选为pET-28a。
以pET-28a为出发载体，构建的含有具有与胶原特异结合能力的神经生长因子基因的重组表达载体为pET-CBD-NGF。
所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)或B834等。
以E.coli BL21(DE3)为出发菌株，将pET-CBD-NGF导入E.coli BL21(DE3)获得的重组菌为BL21(DE3)-pET-CBD-NGF。
上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。
培养含有本发明具有与胶原特异结合能力的神经生长因子基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为4小时。
本发明提供了一种具有与胶原特异结合能力的神经生长因子及其编码基因。该神经生长因子是基于神经元与胶原的紧密联系，从改造神经生长因子的角度考虑，通过在成熟的β-NGF分子N端融合一段胶原结合区(collagen binding domain，CBD)，以加强神经生长因子与胶原的结合，在神经生长因子与胶原之间建立一种较强的物理化学力，从而使β-NGF锚定在神经细胞外的胶原上，这样可以保证具有相同活性时，大大减少β-NGF的用量，避免了因β-NGF用量过大造成的风险，同时相对富集的神经生长因子能明显提高神经元的存活能力，进一步促进神经元的分化，从而为神经损伤修复提供了一条新的途径，临床应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为经表达与纯化的具有组氨酸亲和标签的胶原结合结构域与β-NGF成熟肽融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图2A为PC12细胞经CBD-NGF和NAT-NGF诱导后的形态学观察图2B为经CBD-NGF和NAT-NGF诱导后的PC12细胞轴突诱导实验图2C为经CBD-NGF和NAT-NGF诱导后的PC12细胞的MTT实验结果图3A为等量胶原对不同量NAT-NGF和CBD-NGF结合量的检测结果图3B为NAT-NGF和CBD-NGF对胶原的解离常数Kd的计算结果图4为NAT-NGF和CBD-NGF的体外功能实验结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、具有与胶原特异结合能力的神经生长因子编码基因的克隆及其表达与纯化1、设计引物用软件Primer premier 5.05辅助设计三个正向引物(CBDU，NGFU1和NGFU2，序列见表1)和两个反向引物(CBDD和NGFD)，序列见表1，其中，CBDU(引入限制性内切酶Nde I识别位点)与CBDD(引入限制性内切酶Hind III识别位点)用于扩增胶原结合结构域与连接肽(LINKER)的编码序列，其中，胶原结合结构域保守的氨基酸序列为TKKTLRT(序列表中的SEQ ID №1)，连接肽的氨基酸序列为GSAGSAAGSGGK；NGFU1(引入限制性内切酶Nde I识别位点)与NGFD(引入终止密码子和限制性内切酶Xho I识别位点)用于扩增β-NGF编码序列；NGFU2(引入限制性内切酶Hind III识别位点)与NGFD(引入终止密码子和限制性内切酶Xho I识别位点)也用于扩增β-NGF编码序列。
表1引物序列
2、具有与胶原特异结合能力的神经生长因子编码基因的PCR扩增将CBDU与CBDD互为模板，以搭桥PCR的方式扩增胶原结合结构域与连接肽的编码序列，50μl PCR反应体系为引物CBDU与CBDD各1pmol/μl，dNTPs 200μmol/μl，Taq酶1ul，用ddH2O补充反应体系至50μl。PCR反应条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约70bp的条带。回收并纯化该目的条带后，将其用限制性内切酶Nde I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的原核表达载体pET28a(Novagen公司)连接，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的胶原结合结构域与连接肽的编码序列，将正确连接有该序列的重组载体命名为pET-CBD。
以人β-NGF基因的全长cDNA(GenBank号NM 002506)为模板，分别在由NGFU1和NGFD组成的引物对，及由NGFU2和NGFD组成的引物对的引导下PCR扩增人β-NGF基因，50μl PCR反应体系为上、下游引物各1pmol/μl，dNTPs 200μmol/μl，Taq酶1ul，用ddH2O补充反应体系至50μl。PCR反应条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃充分延伸10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到两条大小约350bp的条带。回收并纯化两条目的条带后，将NGFU1和NGFD的扩增条带用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切后与经同样酶双酶切的原核表达载体pET28a连接，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的具有组氨酸亲和标签的β-NGF成熟肽的编码序列，该序列具有序列表中的SEQ ID №5的核甘酸序列，序列表中的SEQID №5由420个碱基组成，编码序列表中SEQ ID №4的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №4由139个氨基酸残基组成，将正确连接有该序列的重组载体命名为pET-NAT-NGF；同时将NGFU2和NGFD的扩增条带用限制性内切酶HindIII和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的原核表达载体pET-CBD连接，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的具有组氨酸亲和标签的胶原结合结构域与β-NGF成熟肽融合蛋白的编码序列，该序列具有序列表中的SEQ ID №3的核甘酸序列，序列表中的SEQ ID №3由480个碱基组成，自5’端第16-33位碱基编码组氨酸亲和标签序列，自5’端第67-87位碱基编码胶原结合结构域的保守序列，自5’端第127-480位碱基编码β-NGF，自5’端第88-126位碱基编码连接肽序列，编码序列表中SEQ ID№2的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №2由159个氨基酸残基组成，将正确连接有该序列的重组载体命名为pET-CBD-NGF。
3、具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的表达及纯化将步骤1构建的具有组氨酸亲和标签的β-NGF成熟肽的编码序列的原核表达载体pET-NAT-NGF和具有组氨酸亲和标签的胶原结合结构域与β-NGF成熟肽融合蛋白的编码序列的原核表达载体pET-CBD-NGF分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于LB平板上，在37℃下培养，挑选单克隆转接至LB液体培养基中在37℃下培养12-24小时，再以2％的比例转接至100mL LB液体培养基中，在37℃下培养3小时至OD600值约为0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养4小时。培养结束后，8000rpm离心收集菌体，用PBS(NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g，NaH2PO40.4g溶于100ml蒸馏水，pH7.2)洗涤后再次离心收集菌体，然后用10mL PBS重悬菌体，超声破碎菌体，得到重组蛋白粗提液。离心收集包涵体，经洗涤、溶解，利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析柱(Amersham biosciences)进行纯化。将纯化后的两种表达产物进行透析复性，超滤浓缩处理，然后将蛋白质溶剂体系用柠檬酸缓冲液(柠檬酸0.4g，柠檬酸钠2.38g，溶于100mL蒸馏水，pH6.0)置换，4℃保存。对pET-CBD-NGF的表达及纯化产物进行15％SDS-PAGE检测，检测结果如图1所示(泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为超声破碎后的表达菌体，泳道3为纯化后的包涵体(还原条件下)，表达获得了分子量约15.4Kd的重组蛋白，与预期结果相符，从图中可以看出目的蛋白主要以包涵体的形式表达，经纯化后获得了纯度较高的具有与胶原特异结合能力的神经生长因子，即具有组氨酸亲和标签的胶原结合结构域与β-NGF成熟肽融合蛋白，将该蛋白命名为CBD-NGF，将表达该蛋白的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)-pET-CBD-NGF。将表达的具有组氨酸亲和标签的β-NGF成熟肽命名为NAT-NGF。
实施例3、具有与胶原特异结合能力的神经生长因子的活性检测大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12可在NGF诱导下分化生成轴突，此外，NGF可以促进神经元的存活，因此，通过PC12(购自协和医科大学基础医学院细胞库)轴突诱导实验和MTT实验检测实施例2获得的CBD-NGF和NAT-NGF的活性(Howe，C.L.，Depolarization of PC12 cells induces neurite outgrowth and enhances nervegrowth factor-induced neurite outgrowth in rats.Neurosci Lett，2003.351(1)p.41-5.)，方法为用浓度为0-64nM的CBD-NGF和NAT-NGF刺激PC12细胞，以未经刺激的PC12细胞为对照，结果作用一天后，PC12细胞有轴突诱导生成(见图2A)；计算长轴突细胞比例，统计结果如图2B所示，可以看出随着CBD-NGF浓度的升高，长轴突细胞比例也随着升高，显示出剂量依赖效应，且经过统计分析，具有胶原结合区的β-NGF(CBD-NGF)与不带有胶原结合区的β-NGF(NAT-NGF)存在显著性差异(*p＜0.05；**p＜0.01)；此外，经β-NGF作用三天后进行MTT实验，结果如图2C所示，同样，随着β-NGF浓度的升高，OD492值也随着升高，说明存活细胞的数量升高。上述实验结果都显示了剂量依赖效应，且经过统计分析，两种蛋白的实验结果存在显著性差异(*p＜0.05；**p＜0.01)。此结果说明经过透析复性的蛋白CBD-NGF和NAT-NGF都具有生物活性，而且CBD-NGF的活性显著高于NAT-NGF。
实施例4、CBD-NGF的胶原结合能力检测利用基因工程技术及微生物发酵制备CBD-NGF，目的在于在保证其活性的同时，增强其对组织工程用胶原三维支架材料的结合能力，以降低β-NGF的有效用量。现用改进的ELISA实验分别检测了NAT-NGF和CBD-NGF对胶原膜的结合能力(Finnis，M.L.and M.A.Gibson，Microfibril-associated glycoprotein-1(MAGP-1)bindsto the pepsin-resistant domain of the alpha3(VI)chain of type VI collagen.J Biol Chem，1997.272(36)p.22817-23.)，并根据Matsushita提供的方法(Matsushita，O.，et al.，A study of the collagen-binding domain of a 116-kDaClostridium histolyticum collagenase.J Biol Chem，1998.273(6)p.3643-8.)计算两种蛋白对胶原的解离常数Kd。将剂量逐渐增大的NAT-NGF和CBD-NGF分别加载在等量的I型胶原制备的胶原膜(6.0mg)上，充分吸附后，经PBS洗涤掉不能结合的蛋白，等量胶原(6.0mg)对不同量NAT-NGF和CBD-NGF结合量的检测结果如图3A所示，在相同的蛋白加载量情况下，CBD-NGF在胶原膜上的保留量明显高于NAT-NGF，表明前者的结合效率明显高于后者。此外，NAT-NGF和CBD-NGF的解离常数Kd分别为1.50μM和0.51μM(见图3B)，根据对Kd的定义，蛋白的Kd值越小，对胶原的结合能力越强。上述实验结果证明，与NAT-NGF相比，CBD-NGF对胶原的结合能力得到显著提高。
实施例5、CBD-NGF的体外功能实验首先将浓度逐渐提高的NAT-NGF和CBD-NGF分别加载在用酸性胶原(来源于鼠尾)包被(每孔0.2mg胶原)的48孔板，吸附1小时后，用PBS洗两遍，然后将PC12细胞接种在孔板中，每孔接种的细胞数为5×103，37℃培养3天后，用MTT法检测存活的细胞数，检测结果如图4所示，与NAT-NGF相比，CBD-NGF在胶原上具有更高的活性，在体外可以更好的促进PC12细胞的存活和生长，可用于临床上的神经损伤修复。
序列表<160>5<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr1 5<210>2<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Ser Ala Gly20 25 30Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ser His Pro Ile Phe35 40 45His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
50 55 60Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu65 70 75 80Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu85 90 95Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile100 105 110Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val115 120 125Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg130 135 140Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg145 150 155<210>3<211>480<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atgactaaga aaaccctgcg tactggtagc gcgggcagtg ctgcgggttc tggcggtaag120ctttcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc180gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg240ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg300gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat360tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg420cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagatga480<210>4
<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu20 25 30Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr35 40 45Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn50 55 60Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg65 70 75 80Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His85 90 95Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr100 105 110Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala115 120 125Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg130 135<210>5<211>420<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atgtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc120gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg180ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg240gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat300tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg360cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagatga420
权利要求
1.具有与胶原特异结合能力的神经生长因子，是在神经生长因子β亚基的氨基端融合胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。
2.根据权利要求1所述的神经生长因子，其特征在于所述神经生长因子的氨基端连接有由6个组氨酸组成的组氨酸亲和标签序列。
3.根据权利要求2所述的神经生长因子，其特征在于所述神经生长因子具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
4.编码权利1所述的神经生长因子的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中的SEQ ID №3的DNA序列。
6.一种权利要求1所述的神经生长因子的表达方法，是构建含有权利要求4所述基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使具有与胶原特异结合能力的神经生长因子基因表达。
7.根据权利要求6所述的表达方法，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体为pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a。
8.根据权利要求7所述的表达方法，其特征在于所述重组表达载体为pET-CBD-NGF。
9.根据权利要求6或7或8所述的表达方法，其特征在于所述宿主为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)或B834；以E.coli BL21(DE3)为宿主构建的重组菌为BL21(DE3)-pET-CBD-NGF。
10.根据权利要求6或7或8所述的表达方法，其特征在于培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mmol/L，诱导温度为35-39℃，诱导时间为2-4小时。
全文摘要
本发明公开了一种神经生长因子及其编码基因与应用。该具有与胶原特异结合能力的神经生长因子，是在神经生长因子β亚基的氨基端融合胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。本发明的神经生长因子可以保证具有相同活性时，大大减少β－NGF的用量，避免了因β－NGF用量过大造成的风险，同时相对富集的神经生长因子能明显提高神经元的存活能力，进一步促进神经元的分化，从而为神经损伤修复提供了一条新的途径，临床应用前景广阔。
文档编号C12N15/12GK1869072SQ20061008150
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者孙文杰, 林航, 戴建武 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所