本发明涉及生物工程领域，更具体地说，涉及菊花CmACO基因单克隆抗体的制备及鉴定方法。
背景技术：
：菊花是在植物分类学中是菊科、菊属的多年生宿根草本植物。按栽培形式分为多头菊、独本菊、大立菊、悬崖菊、艺菊、案头菊等栽培类型；有按花瓣的外观形态分为园抱、退抱、反抱、乱抱、露心抱、飞午抱等栽培类型。不同类型里的菊花又命名各种各样的品种名称。菊花是中国十大名花第三，花中四君子(梅兰竹菊)之一，也是世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，产量居首。因菊花具有清寒傲雪的品格，才有陶渊明的“采菊东篱下，悠然见南山”的名句。中国人有重阳节赏菊和饮菊花酒的习俗。唐·孟浩然《过故人庄》：“待到重阳日，还来就菊花。”在古神话传说中菊花还被赋予了吉祥、长寿的含义。菊花是经长期人工选择培育的名贵观赏花卉，公元八世纪前后，作为观赏的菊花由中国传至日本。17世纪末叶荷兰商人将中国菊花引入欧洲，18世纪传入法国，19世纪中期引入北美。此后中国菊花遍及全球。菊花为多年生草本，高60-150厘米。茎直立，分枝或不分枝，被柔毛。叶互生，有短柄，叶片卵形至披针形，长5-15公分，羽状浅裂或半裂，基部楔形，下面被白色短柔毛，边缘有粗大锯齿或深裂，基部楔形，有柄。头状花序单生或数个集生于茎枝顶端，直径2.5-20厘米，大小不一，单个或数个集生於茎枝顶端；因品种不同，差别很大。总苞片多层，外层绿色，条形，边缘膜质，外面被柔毛；舌状花白色、红色、紫色或黄色。花色则有红、黄、白、橙、紫、粉红、暗红等各色，培育的品种极多，头状花序多变化，形色各异，形状因品种而有单瓣、平瓣、匙瓣等多种类型，当中为管状花，常全部特化成各式舌状花；花期9-11月。雄蕊、雌蕊和果实多不发育。菊花为多年生宿根亚灌木。繁殖苗的茎，分为地上茎和地下茎两部分。地上茎高0.2-2米，多分枝。幼茎色嫩绿或带褐色，被灰色柔毛或绒毛。花后茎大都枯死。次年春季由地下茎发生孽芽。菊花叶系单叶互生，叶柄长1-2厘米，柄下两侧有托叶或退化，叶卵形至长圆形，边缘有缺刻及锯齿。叶的形态因品种而异，可分正叶、深刻正叶、长叶、深刻长叶、圆叶、葵叶、蓬叶和船叶等8类。菊花的花(头状花序)，生于枝顶，径约2-30厘米，花序外由绿色范片构成花苞。花序上着两种形式的花：一为简状花，俗称"花心"，花冠连成简状，为两性花，中心生一雌蕊，柱头2裂，子房下位1室，围绕花住主5孜聚药雄蕊；另一为舌状花，生于花序边缘，俗称"花瓣"，花内雄蕊退化，雌蕊1枚。舌状花多形大色艳，形状分平、匙、管、桂、畸等5类。瘦果(一般称为"种子")长1-3毫米，宽0.9-1.2毫米，上端稍尖，呈扁平楔形，表面有纵棱纹，褐色，果内结一粒无胚乳的种子，果实翌年1-2月成熟，千粒重约1克。菊花品种具有极大多样性，分类工作者们探讨菊花的原祖。或认为野菊是菊花的原始祖先，或认为甘菊是原祖，或认为它的原祖是小红菊，或者开出一系列的可能的原祖名单。中国科学工作者有的还进行过属间杂交实验，在探讨菊花真源方面做了一些推测性和实验性工作。无论推测和实验，都是试图把菊花的来源落实于该属的某一个或某两个种上，并且试图指出，在这些浩瀚的品种中，哪一个品种最为原始，即是说，想找出最原始的菊花品种。可以肯定，菊花的来源是多方面，是多元而不是单元起源。菊花是异花受粉植物。人们在长期的实践过程中，运用种间，甚至属间杂交的办法，来获取菊花的新性状，并通过返交、互交等有性过程来获得新性状的分离。这样如此返复的遗传重组合和性状的分离，新性状就越来越多。在这个过程中，有意识的人工杂交和随机的自然选择都可以同时出现或交替发生。但是，去劣择优的人工选择过程，却永远起着主导作用。菊花染色体极其有限。仅记录到菊花是6倍体，2n＝54。菊花新品种产生的另一个可能的途径是体细胞的突变(芽变)，用固定芽变的办法来获得新品种。菊花是世界四大切花之一，人们首先认识和利用菊花的药用价值，然后逐步发展到对食用和观赏价值的开发，随着菊花在绿化工程、药物工程的应用越来越广，对菊花的需求量也日益增多，因此急需加大菊花繁殖及创新工作的进度。乙烯(Ethylene，ETH)在特定浓度下对不定根的生成的影响具有双重性，既有抑制，也有促进。乙烯能促进植物下胚轴形成较多的根源基，能抑制根的伸长，同时又使下胚轴变粗。研究表明，当下胚轴基部的乙烯增多，IAA水平高时，则促进生根，但如果持续增高达到一定程度时，则会抑制IAA向下运输，抑制生根，因此乙烯在植物扦插生根中起着至关重要的作用。ACO是乙烯生物合成的一个重要限速酶，研究菊花ACO基因的单克隆抗体制备及鉴定对难生根植物繁殖提供理论参考，为生产上加快植物扦插生根提高其成活率提供技术支持。目前对乙烯在菊花生根过程中的作用研究还是鲜有报道，其合成途径中关键酶的抗体制备及功能研究还是空白。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了菊花CmACO基因单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤一，制备菊花CmACO基因并测序；步骤二，从所述菊花CmACO基因的氨基酸序列中找出抗原片段，并合成菊花CmACO抗原蛋白；步骤三，用所述菊花CmACO抗原蛋白免疫实验动物，并取动物细胞与骨髓瘤细胞融合并用抗原包被，得到杂交瘤细胞株。步骤四，将所述杂交瘤细胞株进行增殖、纯化和筛选，得菊花CmACO基因单克隆抗体。进一步的，所述菊花CmACO基因的氨基酸序列为：METFPIVNMEKLNGEERAATLNLINDACENWGFFEIVNHGISTELLDTVEKMTKGHYKKCMEDRFKEMVASKGLEAVQSEIEDLDWESTFYLRHLPVSNISEVPDLEDEYRKVMKLFAEELEKLAENLLDIFCENLGLEKGYLKKAFYGAGAKGPTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGVILLFQDDKVSGLQLLKDDKWVDVPPMHHSIVINLGDQLEVITNGRYKSVMHRVIAQTDGTRMSIASFYNPGSDAVIYPAPELVNKEAEKSSMYPKFVFEDYMKLYAEVKFQAKEPRFEAFKTMQEAVSVSPIATA。进一步的，所述步骤一中，制备所述菊花CmACO基因包括如下步骤：步骤一，根据菊花EST数据库设计引物；步骤二，将所述引物通过RT-PCR得到菊花CmACO基因。进一步的，所述引物包括GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT和CAAGACACCAGACCGATAAT。进一步的，所述实验动物为Balb/c小鼠；所述动物细胞为所述Balb/c小鼠脾细胞；所述骨髓瘤细胞为Sp2/0骨髓瘤细胞。进一步的，所述步骤三的所述免疫试验动物包括如下步骤：步骤一，将所述菊花CmACO抗原蛋白与弗氏完全或不完全佐剂混合，得混合液，对实验动物给药，为第一次免疫；步骤二，第二次免疫给药的所述混合液用量减半，对实验动物给药；步骤三，第三次免疫起，免疫后检测效价；步骤四，最后一次加强免疫，3天后取脾细胞，待用。进一步的，所述步骤四中的所述增殖包括如下步骤：步骤一，用所述弗氏不完全佐剂致敏所述实验动物；步骤二，对所述实验动物给药所述杂交瘤细胞株，得实验动物体液；步骤三，取所述实验动物体液上清液。进一步的，所述实验动物体液为腹水；取所述实验体液上清液的方法为离心。进一步的，所述步骤四中的所述纯化方法为采用ProteinG柱方法进行纯化。提供一种菊花CmACO基因单克隆抗体的鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，用苯酚法提取菊花可溶性蛋白；步骤二，对所述菊花可溶性蛋白进行定量并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；步骤三，通过免疫印迹试验检验菊花可溶性蛋白，验证菊花CmACO基因单克隆抗体。本申请中，制备了高特异性的菊花CmACO单克隆抗体(1A10)，研究了扦插生根过程中ACO的表达特性。从切花菊‘神马’中分离获得了菊花CmACO基因，其ORF全长960bp，编码320个氨基酸，对其氨基酸序列进行分析，根据抗原挑选原则，找到15个抗原片段，将化学合成的肽段与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，用PEG4000进行细胞融合。用相应抗原包被，进行间接Elisa筛选得到阳性杂交瘤细胞，并进行超表达Westernblot验证，获得5株分泌菊花CMACO单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经小鼠腹水制备大量单克隆抗体，采用ProteinG柱纯化腹水。进一步通过免疫印迹分析筛选出1株高特异性的菊花CmACO单克隆抗体(1A10)。用菊花茎基部蛋白免疫印迹检测结果显示，1A10单克隆抗体特异性识别菊花中的ACO蛋白，是研究扦插生根过程中乙烯作用的最佳抗体。菊花是世界四大切花之一，人们首先认识和利用菊花的药用价值，然后逐步发展到对食用和观赏价值的开发，随着菊花在绿化工程、药物工程的应用越来越广，对菊花的需求量也日益增多，因此急需加大菊花繁殖及创新工作的进度。菊花CmACO基因的克隆及CmACO单克隆抗体的制备为菊花繁殖提供了全新的思路和途径。乙烯(Ethylene，ETH)在特定浓度下对不定根的生成的影响具有双重性，既有抑制，也有促进。乙烯能促进植物下胚轴形成较多的根源基，能抑制根的伸长，同时又使下胚轴变粗。研究表明，当下胚轴基部的乙烯增多，IAA水平高时，则促进生根，但如果持续增高达到一定程度时，则会抑制IAA向下运输，抑制生根，因此ETH在植物扦插生根中起着至关重要的作用。ACO是ETH生物合成的一个重要限速酶，研究菊花ACO基因的克隆及单克隆抗体制备及鉴定对难生根植物繁殖提供理论参考，为生产上加快植物扦插生根提高其成活率提供技术支持。最近通过分析矮牵牛转录组发现乙烯和生长素的刺激是扦插不定根形成的调节器。1975年Kohler和Milstein首次建立了B淋巴细胞杂交瘤技术，该技术使人们通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)。McAb最大的优点在于其特异性强、灵敏度高,能大量制备,且不含其他交叉反应性的污染抗体。目前对乙烯在菊花生根过程中的作用研究还是鲜有报道，其合成途径中关键酶的抗体制备及功能研究还是空白，因此CmACO单克隆抗体的研究及制备意义十分重大。附图说明应当理解的是，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本申请中菊花CmACO基因蛋白表位指标分析图；图2为本申请中菊花CmACO基因的PCR产物凝胶电泳；图3为本申请中菊花CmACO基因与其他物种ACO同源物氨基酸比对及进化聚类分析；图4为本申请中菊花CmACO基因抗体过表达初筛；图5为本申请中菊花茎基部总蛋白单向电泳图谱；图6为本申请中菊花生根过程中茎基部ACO的检测；具体实施方式提供了菊花CmACO基因单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤一，制备菊花CmACO基因并测序；步骤二，从所述菊花CmACO基因的氨基酸序列中找出抗原片段，并合成菊花CmACO抗原蛋白；步骤三，用所述菊花CmACO抗原蛋白免疫实验动物，并取动物细胞与骨髓瘤细胞融合并用抗原包被，得到杂交瘤细胞株。步骤四，将所述杂交瘤细胞株进行增殖、纯化和筛选，得菊花CmACO基因单克隆抗体。需要理解的是，基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段(部分病毒如烟草花叶病毒、HIV的遗传物质是RNA)。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)。带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。组成简单生命最少要265到350个基因。上述，本申请中实验材料分别为：1、切菊花品种“神马”，栽植于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。取插穗茎基部约0.8cm，液氮速冻后于-80℃超低温冰箱保存，以备提取RNA或蛋白质。2、Sp2/0骨髓瘤细胞3、Balb/c小鼠购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司。进一步的，所述菊花CmACO基因的氨基酸序列为：METFPIVNMEKLNGEERAATLNLINDACENWGFFEIVNHGISTELLDTVEKMTKGHYKKCMEDRFKEMVASKGLEAVQSEIEDLDWESTFYLRHLPVSNISEVPDLEDEYRKVMKLFAEELEKLAENLLDIFCENLGLEKGYLKKAFYGAGAKGPTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGVILLFQDDKVSGLQLLKDDKWVDVPPMHHSIVINLGDQLEVITNGRYKSVMHRVIAQTDGTRMSIASFYNPGSDAVIYPAPELVNKEAEKSSMYPKFVFEDYMKLYAEVKFQAKEPRFEAFKTMQEAVSVSPIATA。上述，为菊花CmACO基因的氨基酸序列；而菊花CmACO基因序列为：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTTCCCAATTGTGAACATGGAGAAGCTTAACGGCGAGGAAAGAGCTGCAACGTTGAACTTGATCAACGATGCTTGTGAAAACTGGGGGTTCTTCGAGATTGTGAACCATGGCATATCGACTGAGCTTTTGGACACTGTGGAAAAGATGACAAAAGGGCATTACAAGAAGTGTATGGAAGATAGGTTCAAAGAAATGGTCGCCAGCAAAGGGTTAGAAGCGGTTCAAAGTGAAATCGAAGATTTGGACTGGGAGAGCACTTTCTATCTTCGTCATCTACCCGTATCCAACATCTCTGAGGTCCCAGATCTTGAAGATGAGTACAGGAAGGTGATGAAGTTGTTTGCTGAAGAGCTTGAGAAACTAGCTGAGAATCTTTTAGACATATTCTGTGAGAATCTAGGACTAGAGAAAGGTTACCTCAAGAAAGCTTTCTATGGTGCTGGAGCCAAGGGTCCCACCTTCGGGACCAAAGTGAGCAACTATCCCCCATGTCCTAAGCCTGATCTTATCAAGGGTCTCCGGGCCCACACCGATGCTGGCGGCGTTATCTTACTCTTCCAGGACGATAAGGTCAGCGGGCTCCAGCTCCTTAAGGACGACAAATGGGTTGATGTTCCACCGATGCACCATTCCATTGTGATTAACCTGGGTGATCAGCTTGAGGTAATCACTAACGGAAGGTACAAAAGTGTGATGCATAGAGTGATTGCTCAAACTGATGGAACCCGAATGTCGATAGCCTCATTTTACAACCCAGGAAGTGATGCTGTGATCTATCCTGCACCAGAACTAGTAAACAAGGAAGCAGAAAAAAGCAGTATGTACCCGAAGTTTGTGTTTGAGGACTACATGAAGCTCTATGCTGAAGTGAAGTTTCAGGCAAAGGAGCCTAGATTTGAAGCTTTTAAGACCATGCAGGAGGCAGTCAGCGTCAGCCCCATTGCGACGGCTTGAGTGAAGAAATCAACAGTGATGGTGTTTGTGTGTGTTCATTTAGTTAAATAAGATTATAAAGGATTACACCAAAAAAAAAATGAGATGTGTTTGAGTATATTCTAAGGTATTATCGGTCTGGTGTCTTG。进一步的，所述步骤一中，制备所述菊花CmACO基因包括如下步骤：步骤一，根据菊花EST数据库设计引物；步骤二，将所述引物通过RT-PCR得到菊花CmACO基因。进一步的，所述引物包括GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT和CAAGACACCAGACCGATAAT。需要理解的是，EST数据库中序列的获得方法为：登录NCBI网站HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/，选择EST数据库，以切菊花或栽培菊花拉丁名比如Chrysanthemummorifolium或Dendranthemamorifolium为关键词，进行菊花EST数据检索，将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步处理；将下载的数据使用SeqVerterTM软件进行序列格式转化为DNAStar进行处理，去除序列中污染的克隆载体序列。上述，根据根据菊花EST数据库信息，设计一对引物分别为：CmACOF：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT，CmACOR：CAAGACACCAGACCGATAAT，通过RT-PCR得到目的片段、并进行测序。需要理解的是，RT-PCR为逆转录PCR(reversetranscriptionPCR)或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。检测基因表达的方法，参见NorthernBlot法。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)反转录酶。在完成逆转录过程之后,通过PCR进行定量分析的时候，随着技术的发展，real-timePCR(实时荧光PCR)或ddPCR(数字PCR)技术也被用来做定量分析，它们比普通PCR进行定量分析时灵敏度更高，定量更精确。上述，以CmACOF和CmACOR翻译的氨基酸序列为材料，应用DNAStar中的多种方法预测抗原细胞表位。最后从中挑选15条10肽抗原片段进行合成。将合成的15条多肽进行串联，连接到H载体上，进行原核表达并纯化，即为CmACO抗原蛋白。上述，通过RT-PCR扩增获取目的基因中间片段，并进行测序。根据引物CmACOF和CmACOR，以切花菊品种‘神马’cDNA为模板，扩增到与预期大小吻合的1104bp的中间片段(如图2)，割胶纯化回收目的片段后，连接T载体并转化大肠杆菌TOP10感受态，挑选阳性克隆，摇菌并测序。对测序结果进行分析，确定得到了CmACO基因cDNA完整序列，开放阅读框(ORF)为960bp，编码320个氨基酸。预测分析，蛋白大小为77.94kD，等电点是4.9。将克隆所得的CmACO基因编码得到的氨基酸序列与NCBI上的已登录的其它作物的ACO基因编码的氨基酸进行比对。可以发现克隆所得菊花CmACO基因与其它作物中的ACO非常类似，它们都具有高度的ACO保守区(图3)。比对结果显示，菊花CmACO基因编码得到的氨基酸序列与莴苣氨ACO基因编码的氨基酸序列的相似性最高。进一步的，所述实验动物为Balb/c小鼠；所述动物细胞为所述Balb/c小鼠脾细胞；所述骨髓瘤细胞为Sp2/0骨髓瘤细胞。进一步的，所述步骤三的所述免疫试验动物包括如下步骤：步骤一，将所述菊花CmACO抗原蛋白与弗氏完全或不完全佐剂混合，得混合液，对实验动物给药，为第一次免疫；步骤二，第二次免疫给药的所述混合液用量减半，对实验动物给药；步骤三，第三次免疫起，免疫后检测效价；步骤四，最后一次加强免疫，3天后取脾细胞，待用。上述，用菊花CmACO抗原蛋白免疫鼠龄为10周的雌性Balb/c健康小鼠3只。流程如下：将CmACO抗原蛋白与弗氏完全或不完全佐剂1:1混合(抗原蛋白含量为100μg)充分乳化后，采用多点皮下注射的方法，免疫Balb/c小鼠。两周后，第二次免疫，采用弗氏不完全佐剂，用量减半(抗原蛋白含量与50μg)，用腹腔注射的方法免疫小鼠。两周后，第三次免疫，用量和方法与第二次免疫相同。从第三次免疫起，免疫后隔周采用Elisa的方法检测小鼠血清效价，效价达到1:40000以上后准备融合。最后一次加强免疫，免疫剂量在400μg，采用静脉注射的方法。3d后，取脾细胞融合。进一步的，所述步骤四中的所述增殖包括如下步骤：步骤一，用所述弗氏不完全佐剂致敏所述实验动物；步骤二，对所述实验动物给药所述杂交瘤细胞株，得实验动物体液；步骤三，取所述实验动物体液上清液。进一步的，所述实验动物体液为腹水；取所述实验体液上清液的方法为离心。进一步的，所述步骤四中的所述纯化方法为采用ProteinG柱方法进行纯化。上述，将免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，鉴定其可以产生目标抗体后，立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞并能重新进行克隆，用非竞争酶免疫试验测定抗原抗体的亲和力优选的，取7周龄的Balb/c小鼠，用弗氏不完全佐剂致敏Balb/c小鼠，500μL/只。致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞悬液，8d后采集小鼠腹水，设定离心机转速为12000r/min，离心5min后收集上清液。将从小鼠腹水中提取的大量单克隆抗体采用ProteinG柱方法进行纯化。优选的，细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14d收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。总共得到9株细胞株，用合成的多肽去偶联BSA及ELISA检测后发现其中的7株针对的表位是PKPDLIKGLR，1株针对的表位是VSNISEVPDL，还有1株没有检测到表位信息(X表位是指在表位鉴定实验中，由于该细胞组上清的ELISA信号在阳性阈值附近，因此表位信息判断模糊)。亲和力数据及ELISA检测的效价见表1。表1亲和力信息及ELISA检测数据克隆号表位编号表位序列亲和力ELISA效价1G12X5.53E-09128K2J165VSNISEVPDL3.81E-09256K1I22PKPDLIKGLR5.67E-09128K1D192PKPDLIKGLR5.59E-09256K1M192PKPDLIKGLR5.76E-09128K1P152PKPDLIKGLR5.53E-09128K1G122PKPDLIKGLR6.27E-09128K1A102PKPDLIKGLR6.42E-09512K提供一种菊花CmACO基因单克隆抗体的鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，用苯酚法提取菊花可溶性蛋白；步骤二，对所述菊花可溶性蛋白进行定量并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；步骤三，通过免疫印迹试验检验菊花可溶性蛋白，验证菊花CmACO基因单克隆抗体。构建真核质粒SalI和KpnI双酶切后连接到PEGFP载体上，带有Myc标签。用构建的真核质粒去转染293T细胞后，进行细胞裂解得到的蛋白去做WB实验。CmACO蛋白大小为36.18KD，Myc标签为8KD，加起来是在44KD左右。泳道2-7分别对应着5株细胞株和Myc标签，用Western-blot的方法进行特异性检测。一抗：1D19，IM19，IP15,1G12，1A10，1A10稀释度为1:200，Myc抗体稀释度为1:1000。二抗：anti-mouse二抗，稀释度为1:5000。第2-6泳道(图4)分别对应1D19，IM19，IP15,1G12，1A10，1A10这5株菊花ACO抗体，第7泳道对应Myc抗体，这6个泳道所对应的蛋白大小和预期蛋白的大小吻合，说明克隆特异性状态良好。过表达发现1A10特异性好，并且从ELISA的检测结果也可以看到1A10效价最高，所以我们选择1A10做大量抗体制备。间接竞争ELISA法检测抗体和图4中的5株ACO抗体与菊花可溶性蛋白进行交叉反应性。结果如表2所示，菊花ACO蛋白只与IA10抗体发生特异性反应，而与其它抗体交叉反应性均小于1，说明IA10效果不错，进行大量制备。先用石蜡注入小鼠14d后，然后将1A10细胞株注入小鼠腹腔内，制备大量的腹水，进行ProteinG纯化得到纯化的抗体。用纯化的1A10抗体和提取的菊花蛋白进行内源WB验证。提取菊花茎基部蛋白，检测提蛋白效果(图5)，之后用纯化好的1A10检测菊花中ACO蛋白。一抗：1A10株抗体，稀释度为1:200二抗：anti-mouse二抗，稀释度为1:5000用提取的不同浓度梯度的菊花茎基部蛋白和1A10株抗体进行WB实验，发现在36KD处有条带，可以证明是1A10株抗体可以识别菊花里的ACO蛋白。(图6)表2抗体与菊花可溶性蛋白的交叉反应性克隆号ID19IM19IP15IG12IA10Myc交叉反应率(％)<1<1<1<1100<1下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。实施例1、依据菊花EST数据库信息，设计一对引物：CmACOF：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTTCmACOR：CAAGACACCAGACCGATAAT通过RT-PCR得到目的片段并测序。2、以CmACOORF翻译的氨基酸序列为材料，应用DNAStar中的多种方法预测抗原细胞表位。表位图可综合显示目标蛋白中各区域的表位指标以及被选中的表位，X轴是目标蛋白中各10肽的起始位置。Y轴是表位指标得分。得分越高，该10肽成为成功表位的可能性越高。灰色曲线是每个10肽的得分曲线。蓝色表示被选中的10肽片段。X轴上短柱表示目标蛋白中亲水性的分布：绿色代表亲水，红色代表疏水。如果目标蛋白中存在信号肽和跨膜区，该区域在X轴下方将用粗横线标识。最后从中挑选15条10肽抗原片段(AVSVSPIATA；PKPDLIKGLR；NKEAEKSSMY；QSEIEDLDWE；VSNISEVPDL；EVKFQAKEPR；SKGLEAVQSE；EKLNGEERAA；KAFYGAGAKG；AFKTMQEAVS；KDDKWVDVPP；RFKEMVASKG；STELLDTVEK；GLEKGYLKKA；NGRYKSVMHR)，由上海艾比玛特生物医药有限公司合成。将合成的15条多肽进行串联，连接到H载体上，进行原核表达并纯化，即为CmACO抗原蛋白。3、用CmACO抗原蛋白免疫鼠龄为10周的雌性BALB/c健康小鼠3只。流程如下：将CmACO抗原蛋白与弗氏完全或不完全佐剂1：1混合(抗原蛋白含量为100μg)充分乳化后，采用多点皮下注射的方法，免疫Balb/c小鼠。两周后，第二次免疫，采用弗氏不完全佐剂，用量减半(抗原蛋白含量与50μg)，用腹腔注射的方法免疫小鼠。两周后，第三次免疫，用量和方法与第二次免疫相同。从第三次免疫起，免疫后隔周采用Elisa的方法检测小鼠血清效价，效价达到1:40000以上后准备融合。最后一次加强免疫，免疫剂量在400μg，采用静脉注射的方法。3d后，取脾细胞融合。4、将免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，鉴定其可以产生目标抗体后，立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞并能重新进行克隆，用非竞争酶免疫试验测定抗原抗体的亲和力5、构建带有Myc标签的真核质粒，转染293T细胞后，裂解细胞提取蛋白进行过表达WB试验。6、取7周龄的Balb/c小鼠，弗氏不完全佐剂致敏Balb/c小鼠，500μL/只。致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞悬液，8d后采集小鼠腹水，设定离心机转速为12000r/min，离心5min后收集上清液。将从小鼠腹水中提取的大量单克隆抗体采用ProteinG柱方法进行纯化。7、用苯酚法抽提菊花茎基部的可溶性蛋白，并进行定量。定量后进行SDS-PAGE电泳检测，然后通过Westernblot检测菊花可溶性蛋白，验证单克隆抗体。当前第1页1 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