一种针对PD‑L1的单克隆抗体或抗体片段的制作方法

本发明涉及一种人类程序性死亡受体配体1（PD-L1）的抗体，具体涉及一种针PD-L1的单克隆抗体或抗体片段。

背景技术：

程序性死亡配体1（PD-L1）在慢性传染病，怀孕，组织移植，自身免疫性疾病和癌症的过程中起着免疫抑制的作用。PD-L1通过与程序性死亡受体1（PD-1）相结合来调控免疫系统的应答。PD-1主要表达在T细胞，B细胞和单核细胞的表面。PD-L1也可以通过与它的另外的受体B7-1相互作用来下调T细胞的功能。PD-L1/ PD-1信号通路的激活能下调T细胞的活性和细胞因子的分泌，抑制免疫系统的抗癌活性。PD-L1在很多癌症组织中都有很高的表达，比如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，肺癌，黑色素瘤，卵巢癌，唾液腺癌，胃癌，甲状腺癌等。PD-L1在癌细胞中的过表达有可能与加速癌细胞的侵袭和很低的预后有关。抗人的PD-L1单克隆抗体可以有效的与人的PD-L1结合，阻断PD-L1介导的信号通路，从而激活人体的免疫系统，达到治疗癌症或者其他相关疾病的目的。

目前针对PD-L1受体PD-1的单抗药，如Keytruda（默沙东研发的药物，第一个被FDA批准的PD-1抑制剂）、Opdivo（百时美施贵宝研发的药物，PD-1抑制剂）和Atezolizumab（罗氏研发的药物，PD-L1抑制剂）已经上市，并且在多种癌症的治疗中表现出了显著的治疗效果。

技术实现要素：

本发明提供一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗原与其结合片段能够高特异性的与人PD-L1结合，能够提高淋巴细胞分泌白细胞介素-2（IL-2），增强免疫系统。

为了达到上述目的，本发明提供了一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：重链和轻链，所述的抗体片段为抗原与所述的抗体结合的片段。

其中，所述的重链和轻链包括可变区，所述的可变区包括互补决定区。

其中，所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。

其中，所述的HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：3。

其中，所述的HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：4。

其中，所述的HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：5。

其中，所述的LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：6。

其中，所述的LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：7。

其中，所述的LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或该序列内一个或少数几个氨基酸被其他氨基酸简单置换的SEQ ID NO：8。

所述的重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或选自SEQ ID NO：1中的氨基酸组成的至少80%同源性的氨基酸序列。

所述的轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或选自SEQ ID NO：2中的氨基酸组成的至少80%同源性的氨基酸序列。

所述的抗体或抗体片段以2×10^-9M 或更低的K_D与人PD- L1结合，并且与人PD-L2结合不显著或不结合。

所述的抗体或抗体片段为：嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，或选自以下的抗体片段：Fab、F（ab’）₂、Fv、dAb和scFv。

所述的全人源抗体为IgG1、IgG2或IgG4全长抗体中的任意一种。

所述的抗体或抗体片段的重链可变区由选自SEQ ID NO：9中的核苷酸序列编码；所述的抗体或抗体片段的轻链可变区由选自SEQ ID NO：10中的核苷酸序列编码。

一种含有所述的核苷酸序列的表达载体。

一种含有所述的表达载体的宿主细胞。

所述的针对PD-L1的全人源单克隆抗体或抗体片段在制备免疫偶联物或其组合物中的用途，所述的免疫偶联物由治疗剂与所述的抗体或抗原与其结合片段共价结合；所述的组合物由所述的免疫偶联物和药学上可用载体组合。

所述的治疗剂包括：细胞毒剂、放射性同位素或免疫抑制剂。

所述的针对PD-L1的全人源单克隆抗体或抗体片段在制备抗肿瘤药物或其组合物中的用途。

所述的肿瘤包括：骨癌，肺癌，皮肤癌，头颈癌，乳腺癌，子宫癌，卵巢癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，前列腺癌，睾丸癌，阴茎癌，膀胱癌，输尿管癌，肾癌，肾盂癌，结肠癌，直肠癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，小肠癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，淋巴瘤，软组织肉瘤，恶性黑色素瘤，慢性或急性白血病，中枢神经系统肿瘤中的任意一种或两种以上；所述的皮肤癌为鳞状细胞癌；所述的淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或T细胞淋巴瘤；所述的慢性或急性白血病为急性髓细胞淋巴癌，慢性髓细胞淋巴癌，急性淋巴细胞癌或慢性淋巴细胞癌；所述的中枢神经系统肿瘤为神经胶质瘤或垂体腺瘤。

所述的针对PD-L1的全人源单克隆抗体或抗体片段在制备抗传染病的药物或其组合物中的用途，所述的传染病包括：由病毒、细菌、真菌或寄生虫中任意一种或两种以上引起的传染病；

其中，所述的病毒包括：HIV、肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、腺病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、人类嗜T细胞病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒中的任意一种或两种以上。

其中，所述的细菌包括：分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌和鼠疫杆菌中的任意一种或两种以上；所述的葡萄球菌为金黄色葡萄球菌，所述的链球菌为肺炎链球菌；所述的奈瑟氏菌为脑膜炎球菌或淋球菌，所述的假单胞菌为绿脓杆菌，所述的芽孢杆菌为炭疽杆菌。

其中，所述的真菌包括：假丝酵母、新型隐球菌、曲霉属、毛霉属(如)、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夹膜组织胞浆菌中的任意一种或两种以上；所述的假丝酵母为白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母或热带假丝酵母，所述的曲霉属为烟曲霉或黑曲霉，所述的毛霉属为毛霉、犁头霉或根霉。

其中，所述的寄生虫包括：溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴、利什曼原虫、贾第虫、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫；所述的贾第虫为兰伯贾第虫，所述的疟原虫为间日疟原虫。

所述的针对PD-L1的全人源单克隆抗体或抗体片段在制备抗炎症性疾病的药物或其组合物中的用途，所述的炎症性疾病指由于淋巴细胞免疫下调所导致的炎症性疾病。

所述的炎症性疾病包括：扁平苔藓癣。

本发明提供的一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗原与其结合片段，具有以下优点：

本发明的抗体和抗体片段与人PD-L1的高亲和力结合，而且与人PD-L2不结合或不显著结合，表明了本发明的抗体和抗体片段的特异性高；

本发明的抗体和抗体片段在混合淋巴细胞反应中能增强IL-2分泌的能力，增强免疫应答；

本发明的抗体和抗体片段阻断了PD-L1 与PD-1受体结合，刺激抗体应答的能力，逆转了调节T细胞的抑制状态，从而使其处于激活状态。

附图说明

图1为实验例1中筛选PD-L1抗原结果的条形图。

图2为实验例4中本发明的抗体与人PD-L1结合程度图。

图3为实验例5中本发明的抗体与人PD-L1结合的亲和力曲线图。

图4为实验例6中本发明的抗体对淋巴细胞分泌IL-2的影响曲线图。

具体实施方式

定义

“免疫应答”是指免疫相关细胞（如淋巴细胞、抗原递呈细胞、巨噬细胞或粒细胞等）在收到抗原刺激之后，产生的一系列的信号传递过程，以及由此产生的免疫相关的生物大分子（如产生抗体、细胞因子或补体等）导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症情况下的正常人细胞或组织。

“信号转导途径”是指信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。

“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明所述的PD-L1受体是一种细胞表面受体。

“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链抗体。

“重链”由重链可变区（VH）和重链恒定区组成。

“重链恒定区”由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。

“轻链”由轻链可变区（VL）和轻链恒定区（CL）组成。

“轻链恒定区”由一个结构域组成。

“重链可变区”和“轻链可变区”可进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，CDR散布在被称为“构架区”(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个 CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1， CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4，重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。

“恒定区”可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

“抗原结合部分”是指保留与抗原(如PD-L1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。“抗原结合部分”中所包括的结合片段包括：(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(2)F(ab’) ₂片段，即包含在铰链区（重链CHl和CH2功能区之间的区域）通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(3)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段； (6)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以利用重组方法连接在一起，能够制成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对构成单价分子称为单链Fv (即scFv)，这种单链抗体也包括在术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

“分离的抗体”是指基本不含特异性结合其它抗原的抗体(如本发明中所述与PD-L1特异性结合的分离的抗体，其基本不含与除PD-L1以外的抗原特异性结合的其他抗体)。但是，与PD-L1特异性结合的分离的抗体与来自其他物种的PD-L1分子（其他抗原）等可能具有交叉反应性。分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指由单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位（被抗原受体特异性识别的抗原部分）的特异性结合和亲和性。

“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种系（如小鼠种系）的CDR序列被移植到人构架序列上的抗体。

“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(1)从将人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由该动物制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从转化表达人抗体的宿主细胞（如转染瘤）中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变，或者当使用人免疫球蛋白（Ig）序列的转基因动物时经历体内体细胞诱变，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列尽管是源自人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不是体内天然存在于人抗体集合的所有组成成分中。

“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类型(如IgM或IgG1)。

“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”能够与术语“与抗原、特异性结合的抗体”互换使用。

“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式（如抗体和其它试剂或抗体的偶联物）。

“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种系（如小鼠种系）的CDR序列被移植到人构架序列上的抗体，在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体（如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体）。

“与人PD-L1特异性结合”的抗体是指以1×10^-8摩尔（M）更低的K_D与人 PD-L1结合的抗体。

“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合，“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离，“K_D”是指解离常数，它是由kd与ka的比值获得(即kd/ka)，用摩尔浓度(M)表示。抗体的K_D值能用本领域建立的常规方法测定，测定抗体K_D的一种优选方法为表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统。

IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的 K_D为10^-8M或更低，但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。

“调控序列”包括启动子、增强子和控制抗体基因转录或翻译的其他表达控制元件。

“受试者”包括任何人或非人类动物，“非人类动物”包括所有脊椎动物（如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等）。

“有效剂量”或“有效量”指可对受试者产生功能或活性的且可被受试者所接受的量。

“药学上可接受的载体”是适用于受试者而无过度不良反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益风险比的载体。

现在结合以下附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

本发明提供了一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：重链和轻链，抗体片段为抗原与抗体结合的片段。重链和轻链包括可变区，所述的可变区包括互补决定区。

其中，重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或保守修饰的SEQ ID NO：3，HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或保守修饰的SEQ ID NO：4，HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或保守修饰的SEQ ID NO：5，LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或保守修饰的SEQ ID NO：6，LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或保守修饰的SEQ ID NO：7，LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或保守修饰的SEQ ID NO：8。

本发明还提供了针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段的制备方法，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使得该DNA与转录和翻译的调控序列有效连接。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和表达调控序列，抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体中的CH区段有效连接，而VL区段与载体中的CL区段有效连接，可以利用本发明的抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因。

本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，要转化的宿主细胞的选择，以及期望的蛋白质表达水平，主要取决于转化的宿主细胞的选择。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列优选能够指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)、猴空泡病毒40（SV40）、腺病毒多瘤病毒的启动子和/或增强子。

重组表达载体还可以编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽，可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端连接符合阅读框，信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，如电穿孔、磷酸钙沉淀或脂质体转染等。虽然，在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体或抗体片段，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为真核细胞（尤其哺乳动物细胞）比原核细胞更容易组装和分泌正确折叠的具有免疫活性的抗体。据报道，原核细胞的表达抗体基因无法高产率地产生活性抗体。

用于表达本发明的抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO骨髓瘤细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）和骨髓瘤细胞（SP2）。特别地，用于CHO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是公开的pFUSE表达系统，此系列表达载体是Invivogen公司推出一组抗体表达载体，可以用来表达各种全长的抗体或者抗体片段。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中而产生抗体。

本发明提供的抗体或抗体片段的制备方法具体如下：

首先，利用本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法，或在宿主细胞转染瘤中获得本发明的抗体或抗体片段；

其次，在获得本发明的单克隆抗体或抗体片段的DNA序列之后，通过基因合成的方式得到该单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；

然后，通过标准的分子克隆技术将这两段序列分别插入两个pFUSE-IgG1抗体表达载体中，将得到的这两个载体同时转染到293F细胞中，悬浮培养；

最后，收集上清液，分离纯化得到本发明的抗体或抗体片段。

本发明还提供了针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段的用途：

（1）作为制备免疫偶联物或其组合物的用途

本发明的抗体或抗体片段能与诸如细胞毒剂、药物(如免疫抑制剂) 或放射性毒素等治疗剂偶联得到偶联物，这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”，包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。

细胞毒剂包括对细胞有害（如杀伤细胞）的任何试剂，包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。

治疗剂还包括：抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氨烯咪胺（decarbazine）、5-氟尿嘧啶和羟基脲）、烷化剂（如氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺铂）、抗生素（如放线菌素D、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素、柔红菌素和阿霉素）及抗有丝分裂剂。

与本发明抗体或抗体片段偶联的治疗性细胞毒剂还包括：倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀（Auristatin）及其衍生物。

可以利用本领域使用的连接体技术将细胞毒素或药物与本发明的抗体偶联，该连接体包括（但不限于）：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体，或者在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体。其中，该蛋白酶是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(组织蛋白酶B、C、D)。

本发明的抗体或抗体片段也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也被称作“放射性免疫偶联物”。该放射性同位素包括（但不限于）：碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立，能够利用类似的方法使用本发明的抗体或抗体片段与放射性同位素制备放射性免疫偶联物。

本发明的免疫偶联物可用于修饰特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽，包括（但不限于）：具有酶活性的毒素或其活性片段（如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素）、肿瘤坏死因子、干扰素-γ及生物学反应调节物。该生物学反应调节物包括（但不限于）：淋巴因子、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及其他生长因子。

（2）作为制备抗肿瘤药物或其组合物的用途

PD-L1在正常人细胞中不表达，在多种人类肿瘤组织细胞中高表达。PD-1与PD-L1的相互作用导致浸润肿瘤的淋巴细胞减少，T细胞受体介导的增殖减少，导致肿瘤细胞的免疫逃脱。抑制PD-L1与PD-1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，当PD-L2与PD-1的相互作用也被阻断时，效应是加合的。因此，PD-L1抗体对PD-L1的阻断可以增强患者中对肿瘤细胞的免疫应答。

目前，骨髓移植可以用来治疗血液肿瘤等疾病，移植物抗宿主病是这种治疗的一种后果，但移植物对肿瘤细胞的应答可以获得治疗性益处，通过利用阻断PD-L1提高植入了肿瘤特异性T细胞的供体的有效性。

抗PD-L1抗体可以单独使用，以抑制癌性肿瘤的和平共处，或者抗PD-L1抗体可以与其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体联合使用。

本发明的抗体或抗体片段制备的抗肿瘤药物或其组合物可以治疗或预防的肿瘤为一般对免疫治疗有应答的肿瘤。上述肿瘤包括（但不限于）：骨癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、睾丸癌、尿道癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、食道癌、小肠癌、直肠癌、肛区癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤、卡波西肉瘤中任意一种或两种以上。

其中，黑色素瘤为皮肤或眼内恶性黑色素瘤，皮肤癌为表皮状癌或鳞状细胞癌，淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤、非何霍奇金淋巴瘤或淋巴细胞性淋巴瘤，淋巴细胞性淋巴瘤为T细胞淋巴瘤，慢性或急性白血病为急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病，中枢神经系统(CNS)肿瘤为原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤。

上述肿瘤还包括：由环境诱发的肿瘤（如石棉诱发的肿瘤）以及转移性癌，特别是表达 PD-L1的转移性癌。

优选的，肿瘤包括：黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌中的任意一种或两种以上。

本发明的PD-L1抗体还可以与双特异性抗体联合应用，该双特异性抗体可以将表达Fcα受体或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞，而且可以利用该双特异性抗体靶向两种不同的抗原。例如，利用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(如Her-2/neu)的双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位，这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。利用PD-L1阻断可以加强这些应答的T细胞，或者可以利用肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体结合将抗原直接递送至树突状细胞（DC）。

肿瘤通过多种机制逃避宿主的免疫监视，但可以通过灭活肿瘤表达的免疫抑制性蛋白质来克服。每种个体的抗体可以与抗PD-L1联用，来抵抗免疫抑制性蛋白质的作用，并且有利于宿主的肿瘤细胞免疫应答。

本发明的抗体或抗体片段也可以与用于激活宿主细胞免疫应答的其他抗体联用。其中，包括DC表面上的分子，这些分子激活DC功能和抗原呈递；抗CD40抗体，其能够有效地替代T细胞辅助活性；对T细胞共刺激分子（如TNFRSF4 的活化抗体），其能提高T细胞活化的水平；阻断阴性共刺激分子（如细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、B和T淋巴细胞衰减蛋白抗体（BTLA））的活性的抗体。

（3）作为制备抗传染病的药物或其组合物的用途

本发明的抗体或抗体片段可以治疗和预防由特定毒素或病原体引起的传染病。类似于在上述肿瘤中的应用，该抗体或抗体片段可以单独使用，也可以作为佐剂或与疫苗组合使用，其能够刺激淋巴细胞对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。

该抗体或抗体片段特别应用于目前没有有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。病原体包括病毒、衣原体、立克次氏体、钩端螺旋体、细菌、真菌和寄生虫。

其中，病毒包括（但不限于）：HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒（如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV和EB）、腺病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、人类嗜T细胞病毒（HTLV）、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒中的任意一种或两种以上。

其中，细菌包括（但不限于）：分枝杆菌、葡萄球菌（如金黄色葡萄球菌）、链球菌（如肺炎链球菌）、奈瑟氏菌（如脑膜炎球菌和淋球菌）、克雷伯氏菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌（如绿脓杆菌）、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌（如炭疽杆菌）、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌和鼠疫杆菌中的任意一种或两种以上。

其中，真菌包括（但不限于）：假丝酵母（如白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母和热带假丝酵母）、新型隐球菌、曲霉属（如烟曲霉和黑曲霉）、毛霉属(如毛霉、犁头霉和根霉)、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夹膜组织胞浆菌中的任意一种或两种以上。

其中，寄生虫包括（但不限于）：溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴、利什曼原虫、贾第虫（如兰伯贾第虫）、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、疟原虫（间日疟原虫）、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫。

该抗体或抗体片段尤其应用于对抗由HIV引起的感染，在感染过程中HIV为逃逸免疫监视呈现改变的抗原。本发明的抗体或抗体片段能够阻断PD-L1的信号途径，使这些新的表位被作为外源物识别时不受PD-L1的负信号影响，从而增强T细胞的应答。

此外，本发明的抗体或抗体片段可以与其他形式的免疫疗法联合，如细胞因子治疗(如干扰素、GM-CSF、G-CSF或IL-2)和双特异性抗体治疗，双特异性抗体治疗能增强肿瘤抗原的呈递。

（4）作为制备抗炎症性疾病的药物或其组合物的用途

本发明的抗体或抗体片段可以治疗或预防慢性炎性疾病，如扁平苔藓或T细胞介导的慢性炎性皮肤粘膜病。扁平苔藓表现出免疫功能低下，存在体液免疫紊乱，因此可以通过抗PD-L1抗体增强T细胞的免疫应答治疗。

（5）其它用途

机体会对肿瘤细胞或肽疫苗产生免疫应答，在此过程中会产生自身反应性，抗PD-L1抗体可以增强自身免疫应答，因此可以利用本发明的抗体或抗体片段联合多种自身蛋白质设计接种方案，以有效地产生对抗这些自身蛋白质的免疫应答，用于治疗与这些自身蛋白质相关的疾病。例如，阿尔茨海默病涉及β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑中沉积，针对Aβ的抗体应答能够清除沉积的Aβ；用于治疗变态反应和哮喘的免疫球蛋白E（IgE），或用于类风湿性关节炎的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。

本发明的抗体或抗体片段还能够增强自身抗体对各种激素的应答，如增强自身抗体对生殖激素的应答可以用于避孕，增强抗体对其它激素或特定肿瘤生长所需的其他可溶性因子的应答。

在制备上述“药物或其组合物”中，“药物”为包含有效剂量的抗体或抗体片段，或由抗体或抗体片段制备的免疫偶联物，“组合物”为抗体或抗体片段、药学上可接受的载体和治疗剂组合，治疗剂包括：疫苗、多特异性或双特异性抗体，药学上可接受的载体包括（但并不限于）：水、盐水、葡萄糖、缓冲液、乙醇、甘油及其组合。在体内或体外施用本发明的药物或其组合物的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择，如注射(静脉或皮下)给药，使用的适宜剂量取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。

本发明的抗体或抗体片段可以在体外或离体培养的细胞，或者在受试者体内施用，从而增强或上调免疫应答。优选的，受试者为需要增强免疫应答的人类患者，尤其适合通过增强T细胞介导的免疫应答治疗疾病的患者。为了实现自身免疫系统抗体的抗原特异性增强，抗PD-L1抗体可以与目标抗原一起给药。

本发明的抗体或抗体片段还可以与治疗剂联合用药，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗方法（如抗肿瘤治疗中进行的放射治疗）共同应用。抗肿瘤的细胞毒剂仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。其中，顺铂以100mg/剂的剂量通过静脉注射给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/mL的剂量通过静脉注射给药，每21天1次。本发明的抗体或抗体片段与化疗剂共同给药，由于两种不同药物的作用机理不同，发挥功能的方式不一样，因而此种给药方式能够解决耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。

部分材料来源说明于此：

PD-L1蛋白：Human PD-L1/CD274（购自Acrobiosysterms，货号为PD1-H82F3）。

全人单链抗体的噬菌体抗体库：构建方法见实验例1（为常州费洛斯药业科技有限公司构建）。

链霉亲和素磁珠：（购自Invitrogen公司）。

酶联免疫微孔板：96半孔低透平底微孔板（购自Corning公司）。

Anti-M13 HRP抗体：（购自赛默飞公司）。

M13辅助噬菌体：（购自Invitrogen公司）。

SOC培养基：（购自上海生工）。

pCGMT噬菌粒载体：（购自Addgene公司）。

XL1-blue细菌：（购自安捷伦公司，货号为200228）。

LB固体培养基平板：将5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，10g琼脂粉溶于1L的双蒸水中，在121℃高温下高压灭菌，然后倒在平板上。

显影液ABTS溶液：（购自赛默飞公司，货号为002024）。

Gelred核酸染料：（购自赛默飞公司）。

pFUSE-IgG1表达载体：（购自 Invivogen公司）。

质粒抽提试剂盒：（购自Qiagen公司）。

限制性内切酶：（购自Takara公司）。

重组酶：（购自Novoprotein公司）。

293Fectin转染试剂：（购自Invitrogen公司，货号为12347500）。

293Freestyle悬浮细胞：（购自赛默飞公司）。

免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段：（购自南京金斯瑞公司）。

BCA法蛋白定量试剂盒：（购自Pierce，货号为23252）。

CBS抗原固定溶液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于1L水中，调整pH值为9.6。

Anti-Human Fc HRP二抗：（购自赛默飞公司）。

96孔底透板：（购自Corning公司）。

Biacore仪器：（购自GE公司，T200）。

Protein A芯片：（购自GE公司）。

CD4+正选择试剂盒：（购自DynalBiotech）。

GM-CSF：（购自R&D Biosystems）。

单核细胞负选择试剂盒：（购自MitenyiBiotech)。

Human IL-2 HTRF kit试剂盒：（购自Cisbio公司）。

AlphsLISA试剂盒：（购自PerkinElmer公司，货号为AL356C）。

Envision^®多标记微孔板检测仪平台：（购自PerkinElmer公司）。

Proxiplate^®微孔板：（购自PerkinElmer公司，货号为6008280）。

实验例1 抗PD-L1抗体的筛选

1. 全人单链抗体的噬菌体抗体库：设计引物扩增抗体的重链可变区和轻链可变区，通过重叠延伸PCR的方式用Linker将重链可变区和轻链可变区连接起来，得到全长的PCR产物，用SfiI酶切PCR产物和pCGMT噬菌粒载体，将连接转化产物电转化入XL1-blue感受态细胞，然后向感受态细胞中加入3mL的SOC培养基，30℃培养1h后，加入终浓度为50µg/mL的氨苄青霉素，10µg/mL的四环素溶液20mL，37℃振荡培养2h。然后加入浓度为10¹³/mL的VCSM13辅助噬菌体50uL，室温孵育1h，中间每隔10min轻摇一次。37℃振荡培养2h，再加入终浓度为70µg/mL的卡纳霉素，30℃过夜培养。离心收集上清，加入浓度为10%的PEG-8000/氯化钠溶液（PEG即聚乙二醇），置于冰浴1h，8000rpm，4℃离心，弃上清液，用2mL浓度为1%的BSA（牛血清白蛋白）的PBS溶液（磷酸缓冲液）充分溶解沉淀，离心收集上清液，即为全人单链抗体的噬菌体抗体库。

2．抗体筛选

取表达全人单链抗体的噬菌体抗体库200μL（含有噬菌体1×10¹²个/mL）与5μg PD-L1抗原混合，室温孵育30 min后加入50μL的链霉亲和素磁珠，与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素磁珠捕获，未结合的噬菌体经0.5% Tween-20的PBS溶液漂洗后被去除，用盐酸甘氨酸（pH 2.2）溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。

接种XL1-Blue细菌200mL，待OD（光密度）达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体，与XL1-Blue细菌在37℃静置30min，菌液涂在氨苄青霉素抗性平板上，第二天洗脱收集氨苄抗性平板上的菌体，在侵染1×10¹²pfu/mL的VCSM13辅助噬菌体后，扩增后进行下一轮筛选，共进行3轮筛选。

将侵染噬菌体的XL1-Blue菌液充分稀释，然后将此菌液涂布于直径为15cm抗性为氨苄青霉素的LB固体培养基平板，每个平板上有100-500个克隆，挑取单克隆抗体，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的各轮噬菌体库进行验证。

3．噬菌体酶联免疫反应

将转染噬菌体的XL1-Blue单克隆菌接种到2mL的96孔细菌培养板（购自Corning公司）中，加入500μL含有四环素抗性的SB培养基，200 rpm转速下37℃摇床4-6 h，检测OD₆₀₀（600nm波长处的吸光值）值接近0.6后，加入1μL的辅助噬菌体，在30℃下摇床过夜，第二天3000g离心取上清待用。

取酶联免疫微孔板，包被抗原4℃过夜，第三天，PBST洗脱之后封闭，然后加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2h，PBST再加入Anti-M13 HRP抗体孵育30min，后用PBST洗3次，加入50μL显影液ABTS。

4．实验结果：

如图1所示，PD-L1抗原在全人抗体噬菌体展示库中进行筛选，经过3轮筛选后，PD-L1抗原酶联免疫反应的信号强度最高是对照抗原的100多倍，上述对照抗原为免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段（human IgG1-Fc），表明经过3轮筛选后能够表达与PD-L1抗原特异性结合抗体的噬菌体不断的被富集。从第3轮筛选后得到的噬菌体库中挑取196个单克隆进行酶联免疫反应验证，最后确定酶联免疫反应的信号强度是对照抗原两倍以上的单克隆作为阳性单克隆，对阳性单克隆进行测序，获得核苷酸编码序列，将获得的序列进行比对分析，重复克隆越多，说明该抗体序列的亲和力越强，以此确定有效富集的核苷酸编码序列。

实验例2构建抗PD-L1全长抗体的pFUSE-IgG1表达载体

将实验例1中筛选得到的噬菌体的核苷酸编码序列为模板，设计PCR引物，分别扩增本出重链可变区和人IgG1的恒定区，通过重叠延伸PCR法将重链可变区序列和人的IgG1区拼接起来，然后通过重组的方法将片段接入pFUSE表达载体（pFUSE表达载体通过限制性内切酶BamH1和BglII作用于酶切位点）中，由此获得本发明的全长抗体重链的pFUSE-IgG1表达载体。同样，设计PCR引物，分别扩增本发明单克隆抗体的轻链可变区和人Lambda链（IgG1的轻链）的恒定区，通过重叠延伸PCR方法将这两段拼接起来，将拼接的片段重组入pFUSE表达载体，由此获得本发明的全长抗体轻链的pFUSE-IgG1表达载体。

实验结果：

上述构建的全长抗体重链的pFUSE-IgG1表达载体和本发明的全长抗体轻链的pFUSE-IgG1表达载体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

实验例3 抗PD-L1全人源单克隆抗体的制备（表达和纯化）

将293Fectin转染试剂与上述获得的真核抗体表达载体按照体积质量比为30μL：30μg的比例混合，加入30μL的293Freestyle悬浮细胞，在125rpm转速下37℃摇床过夜，离心后收集上清，采用HiTrap Protein A HP columns在ÄKTApurifier100蛋白纯化仪上进行抗体蛋白纯化，最后参照BCA法蛋白定量试剂盒的说明书检测抗体浓度。

实验例4 酶联免疫反应（ELISA）检测抗PD-L1全人源单克隆抗体与人PD-L1的结合

96孔底透板的每个孔中均加入50μL 用CBS抗原固定溶液稀释的人PD-L1，每个孔中加入抗原0.05μg，4℃过夜孵育。PBST漂洗三次，加入含牛奶浓度为5%的PBST封闭液，在37℃条件下封闭1h。PBST漂洗三次，加入实验例3获得的抗PD-L1全人源单克隆抗体，在37℃条件下孵育1h，漂洗干燥后加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的Anti-Human Fc二抗，室温震荡孵育30min，用PBS漂洗3次，加入显影底物ABST溶液，最后使用酶标仪读取数值。

实验结果：

如图2所示，横坐标为抗体识别PD-L1抗原的光吸收值，纵坐标为同一抗体识别对照抗原IgG1-Fc的光吸收值，对照组（human IgG1-Fc）的酶联免疫反应的OD值在0.2以下，而阳性组（即抗PD-L1全人源单克隆抗体）的OD值在0.4以上，表明PD-L1抗体识别PD-L1而不识别human IgG1-Fc。

实验例5 检测抗PD-L1全人源单克隆抗体的结合特异性和结合动力学特征

采用多循环动力学的方法检测抗体与抗原亲和力与动力学特征，抗体固定采用捕获法进行，先将抗PD-L1全人源单克隆抗体偶联在Protein A芯片上，然后将PD-L1样品梯度稀释后流过芯片表面，稀释的起始浓度为40nM，稀释倍数为2倍，共稀释6个浓度点，PD-L1就会被已经偶联的抗PD-L1全人源单克隆抗体所捕获，抗原与抗体结合后信号被检测并记录，最后用再生试剂（pH1.5的甘氨酸溶液）将Protein A芯片表面的抗体和抗原样品全部洗脱，并进行新一轮检测。

实验结果：

如图3所示，每一条线代表不同的PD-L1抗体浓度，PD-L1抗体浓度越高，结合的越快，信号越强，说明PD-L1抗体与PD-L1亲和力好，在120秒后置换到PBS溶液中，将抗原与抗体解离，通过Biacore检测证明抗PD-L1全人源单克隆抗体与PD-L1蛋白相互作用，本发明的抗PD-L1全人源单克隆抗体的K_D为5×10^-10。

实验例6 检测抗PD-L1全人源单克隆抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子产生的影响

利用混合淋巴细胞反应证明阻断PD-L1/PD-1途径对效应淋巴细胞的影响，在存在或不存在抗PD-L1全人源单克隆抗体的情况下检测该试验中IL-2的分泌。

使用CD4+正选择试剂盒从PBMC（外周血单个核细胞）中纯化人CD4+T 细胞，树突细胞的来源为通过1000U/mL IL-4（白细胞介素-4）和500U/mL GM-CSF培养7天并纯化的单核细胞（单核细胞用单核细胞负选择试剂盒制备）。每种培养物在200μl总体积中含有10⁵个纯化的人CD4+T细胞和10⁴个树突细胞。抗PD-L1单克隆抗体以不同的抗体浓度加至每种培养物中。不加抗体或用不具有抗原识别能力的人源抗体Fc同种型对照抗体作为阴性对照。细胞在37℃下培养5天，从每个培养中取出100μL培养基进行细胞因子测定。IL-2含量用Human IL-2 HTRF kit试剂盒测定，抗PD-L1全人源单克隆抗体以浓度依赖的方式促进IL-2分泌。

实验结果：

如图4所示，随着抗PD-L1全人源单克隆抗体浓度的增加，混合淋巴细胞反应检测到的IL-2分泌也增加，说明该抗体可以识别PD-L1配体并阻断其与PD1结合，进而促进T细胞激活分泌IL-2。

实验例7检测抗PD-L1全人源单克隆抗体阻断PD-L1配体与PD-1的结合

将待检测的抗PD-L1全人源单克隆抗体以3倍稀释倍数进行浓度梯度稀释，起始浓度点为5μg/μL，共计稀释10个浓度点。检测反应体系分别为待检样品抗体蛋白或抑制剂5μL，生物素化PD-1 5μL，组氨酸标签（His-tag）PD-L1 5μL，链霉亲和素供体珠和受体珠（SA-Donor beads and acceptor beads）混合物5μL，合计20μL。首先配制1X稀释液，然后按照说明书将各个试剂用稀释液配制，分别为4X组氨酸标签PD-L1(20nM)，4X生物素化PD-1(20nM)，4X抗-6X组氨酸AlphaLISA^®受体珠（Anti-6xHis AlphaLISA ^® Acceptor beads）(40 μg/mL) 和链霉亲和素标记的供体珠（Streptavidin Donor beads）(80 μg/mL)混合液。将上述四种液体按照20μL反应体系混合到一起，室温避光孵育90min，在Envision上读取在615nm下的数值。

实验结果：

本发明抗PD-L1全人源单克隆抗体可以有效抑制PD-1蛋白与其配体PD-L1在体外的结合，并且这种抑制呈剂量依赖性，随着抗PD-L1全人源单克隆抗体浓度的提高，PD-1与其配体D-L1的结合逐步受到抑制，检测到的抑制常数IC₅₀为77.57 nmol/L。

综上所述，本发明用于提供一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段能够高特异性的与人PD-L1结合，阻断了PD-L1 与PD-1受体结合，刺激抗体应答的能力，逆转了调节T细胞的抑制状态，增强免疫应答。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

<110> 常州费洛斯药业科技有限公司

<120> 一种针对PD-L1的单克隆抗体或抗体片段

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Pro Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asn Val Gly Ala Gly

20 25 30

Phe Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Leu Ser Gly Asn His Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu

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Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Arg

85 90 95

Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala

1 5

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Ser Asn Val Gly Ala Gly Phe Asp

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Gly Asn His

1

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Leu Ser Gly Pro Val

1 5 10

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtacagc tggttcaatc gggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

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