一种去岩藻糖基化全人源单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及去岩藻糖基化全人源单克隆抗体，具体涉及针对中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的去岩藻糖基化全人源单克隆抗体、其抗原结合片段，及其应用。

背景技术：

现有技术公开了中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV)是一种新型冠状病毒，于2012年6月由沙特阿拉伯病毒学家Ali Moh Zaki在一名死于急性肺炎和急性肾功能衰竭的60岁男性患者的呼吸道上皮细胞中分离出来。所述的MERS病人在临床上表现出与SARS非常相似的症状，故初期曾被称为“类SARS病毒”，其主要症状有发热、咳嗽、呼吸急促，并伴有较高比率的急性肾衰竭，致死率目前超过30％，远高于SARS流行期间约10％的致死率。调查显示，该病毒主要在中东地区流行，但目前在欧洲、北美和亚洲等地均先后出现感染病例。截至2015年7月21日，据世界卫生组织(WHO)的报道全球范围内已有1368例MERS-CoV感染的确诊病例，其中死亡人数至少有490例(http://www.who.int/csr/don/21-july-2015-mers-korea/en/)。目前MERS已波及25个国家，其中最近一波在韩国爆发的疫情发展十分迅速，自2015年5月21日以来已导致至少186人被感染(包括一名旅行至中国患者)，死亡人数已达36人，并且出现了第四代感染者。MERS爆发对全球公共卫生构成严重的威胁，到目前为止，还没有针对MERS-CoV的疫苗或特异性防治药物。所以，迫切的需要开发一种有效的抗病毒药物来对抗这一新兴的全球性威胁。

研究显示了通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源、人源化及全人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际应用前景。上世纪80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界全人源单克隆抗体及新结构抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。而全人源单克隆抗体的发展，给这一领域的生物制品发展带来 了新的希望和远大前景。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如抗甲肝病毒、汉坦病毒、RSV病毒、SARS病毒、亨尼帕病毒、埃博拉病毒等单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击；因此，研制特异性针对MERS-CoV的抗体，用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。

有多个研究课题组报道了针对MERS-CoV的全人源中和抗体的发现，其中目前报道的具有最强中和活性的是从噬菌体展示的超大型Fab抗体库中筛选到的全人源单克隆抗体，m336、m337和m338，它们都被证明具有极高的病毒中和活性，对MERS-CoV假病毒的半抑制浓度(IC50)为0.05～0.017ug/ml(现有技术3)。其中m336抗体的中和活性最强，在浓度低达0.039ug/ml条件下对MERS假病毒感染的Huh-7细胞的抑制率高达90％(IC90)；同样的，m336对MERS-CoV活病毒感染Vero E6细胞诱导产生的CPE现象表现出有效抑制，其IC50为0.07ug/ml，该抗体由于具有很强的病毒中和能力，有潜力被开发为MERS防治药物用于疫情的控制。

抗体依赖的细胞毒性作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)是一种经典的、由抗体Fc区域介导的用于清除感染细胞的免疫效应机理。最近有研究发现，IgG1抗体第297位天冬酰胺的糖基修饰对其免疫效应非常重要，将该位点去岩藻糖基化后，抗体会具有更强的Fcγ受体IIIa的结合能力，因此具有更强的ADCC杀伤效果(现有技术4)。比如说，一些研究证明，去岩藻糖基化的HIV-1广谱中和单克隆抗体b12与未去岩藻糖基化的b12相比，其抑制HIV-1病毒复制和通过ADCC杀伤HIV-1感染细胞的能力都增强了十倍(现有技术5)。通过往表达抗体的细胞的培养基中添加α-甘露糖苷酶抑制剂kifunensine可以生产去岩藻糖基化的抗体。因此，针对MERS-CoV的去岩藻糖基化的抗体有望具有更强的抗MERS活性。

与本发明相关的现有技术有：

1.Zaki,A.M.et al.Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia,N Engl J Med 367,1814-1820(2012).

2.Dimitrov,D.S.Therapeutic antibodies,vaccines and antibodyomes.MAbs 2,347-56(2010).

3.Ying,T.et al.Exceptionally potent neutralization of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol 88,7796-805(2014).

4.Satoh,M.Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies.Expert Opin Biol Ther 6,1161-73(2006).

5.Moldt,B.,et al.A nonfucosylated variant of the anti-HIV-1monoclonal antibody b12has enhanced FcgammaRIIIa-mediated antiviral activity in vitro but does not improve protection against mucosal SHIV challenge in macaques.J Virol 86,6189-96(2012).。

技术实现要素：

本发明目的是针对目前还没有特异性防治中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的药物的现状，提供一种去岩藻糖基化全人源单克隆抗体及其用途，该去岩藻糖基化的全人源单克隆抗体特异性结合MERS冠状病毒表面糖蛋白；涉及的全人源单克隆抗体包括克隆m336和克隆m336-gH；本发明在国际上首次公开了去岩藻糖基化的MERS冠状病毒抗体具有增强的ADCC活性；本发明还公开了这些抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物，以及所公开的抗体和组合物可以用于，比如说，临床上预防或治疗中东呼吸系统综合征。

本发明的全人源单克隆抗体，其主要特征在于此抗体具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，包括能够裂解表达MERS-CoV S蛋白的细胞。

本发明还提供了通过抑制岩藻糖基转移酶活性使得细胞表达去岩藻糖基化的MERS-CoV全人源单克隆抗体的方法。

在本发明一些实施方式中，单克隆抗体，或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列和/或重链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆m336或克隆m336-gH的轻链和/或重链可变区的互补决定区(CDR)。

更具体的，本发明提供了一种含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体，或抗原结合片段，包含：抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2的26-33位，51-58位，和/或97-114位氨基酸。

本发明中，所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相同性，且重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％的相同性。

本发明中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中的单克隆抗体或抗原结合片段是全人源的。

本发明中，所述的单克隆抗体为IgG；抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)₂。

本发明中还提供了含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段的双特异性抗体，及其与一种效应分子偶联，获得的偶联物，其中的效应分子是可检测标记，如，选自荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶，或是毒素或化疗剂，其中的毒素尤其是绿脓杆菌外毒素。

本发明中还提供了一种核酸分子，其编码上述的单克隆抗体或抗原结合片段，双特异性抗体，或所述的偶联物；该核酸分子，可操作地连接至启动子。

本发明中还提供了含有上述核酸分子的质粒及含有所述质粒的宿主细胞，其中质粒是一种病毒质粒。

本发明中还提供了一种在生物样品中检测MERS-CoV表面糖蛋白的方法，包含：含有生物样品，及所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物，在足以形成免疫复合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在MERS-CoV表面糖蛋白；其中样品来源于人类或样品来源于骆驼。

本发明中还提供了一种检测受试者是否患有MERS的方法，包含：

含有来源于疑似感染MERS的受试者的生物样品，及有效剂量的上述的单克隆抗体或抗原结合片段，上述的双特异性抗体，或上述的偶联物，并检测单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合，其中单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合相比阴性对照增加表示受试者患有MERS；其中阴性对照是一个参比标准，或单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物与来源于健康受试者的样品的结合；其中生物样品是血液，血清，血浆，痰液，或活检样品。

进一步，本发明中提供一种药用组合物，含有有效预防剂量的上述的单克隆抗体或抗原结合片段，双特异性抗体，偶联物，核酸，或所述的质粒，和一种药学可接受载体。

本发明中，提供一种在表达所述的单克隆抗体的细胞中添加一种化学物质的方法，其中添加该化学物质的目的是使得表达的针对MERS-CoV的单克隆抗体的Fc区是去岩藻糖基化的；其中针对MERS-CoV的单克隆抗体是全人源抗体；其中细胞是CHO细胞；其中化学物质是kifunensine。

本发明中提供了一种单克隆抗体，或抗原结合片段，其中：轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相同性，且重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:9具有至少90％的相同性。

本发明中，SEQ ID NO:1是m336轻链可变区的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2是m336重链可变区的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3是m336轻链可变区CDR1的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4是m336轻链可变区CDR2的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5是m336轻链可变区CDR3的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6是m336重链可变区CDR1的氨基酸序列；

SEQ ID NO:7是m336重链可变区CDR2的氨基酸序列；

SEQ ID NO:8是m336重链可变区CDR3的氨基酸序列；

SEQ ID NO:9是m336-gH重链可变区的氨基酸序列。

本发明提供了去岩藻糖基化的针对中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的全人源单克隆抗体，该抗体具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，包括能够裂解表达MERS-CoV S蛋白的细胞。本发明还提供了通过抑制岩藻糖基转移酶活性使得细胞表达去岩藻糖基化的MERS-CoV全人源单克隆抗体的方法。利用所制得的抗体可制备预防或治疗中东呼吸系统综合征的药物制剂。

附图说明

图1.去岩藻糖基化的m336抗体能够更有效的诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用，

其中，m336F代表去岩藻糖基化的m336抗体，m102.4为无关抗体对照，橙色(293T-S-m336F)代表去岩藻糖基化的m336抗体针对表达了MERS-CoV S蛋白的293T细胞的ADCC作用，草绿色(293T-m336F)代表去岩藻糖基化的m336抗体针对未表达MERS-CoV S蛋白的293T细胞的ADCC作用，蓝色(293T-S-m336)代表未去岩藻糖基化的普通m336抗体针对表达了MERS-CoV S蛋白的293T细胞的ADCC作用。

图2.利用ELISA检测Fab与MERS冠状病毒S蛋白的结合能力，

其中，绿色为m336-gH克隆，红色为m336克隆，m336-gL、m336-gL-FR与m102.为对照抗体。

图3.抗体对MERS冠状感病毒中和能力的检测，

其中，绿色为m336-gH克隆，红色为m336克隆。

具体实施方式

实施例1抗体的制备、表达与纯化及检测

Fab及IgG1抗体的制备、表达、纯化，及Fab转换成IgG1的方法参考文献报道(3)的方法进行；

m336-gH基因系通过定点突变试剂盒，将m336的重链可变区59位氨基酸由S突变为N而来，并使用与m336相似的表达纯化条件进行制备；

Fab制备的具体方法为：将含有克隆m336或m336-gH的质粒转入HB2151感受态细胞，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种SB细菌培养液，在30度IPTG诱导条件下表达10-12小时；收获细菌并从中提取纯化Fab。IgG1抗体使用稳定转染表达的CHO细胞进行制备表达；去岩藻糖基化的IgG1抗体系在稳定转染表达的CHO细胞培养液中加入kifunensine制备而得；Fab使用Ni-NTA树脂进行纯化，IgG1使用Protein G树脂进行纯化；

检测去岩藻糖基化的m336抗体诱导ADCC作用：

将25微升的293T细胞或表达了MERS-CoV S蛋白的293T细胞(2.5×10⁴个)铺至96孔板，然后将m336抗体，去岩藻糖基化的m336抗体(m336F)和无关抗体m102.4梯度稀释，分别加入到未表达及表达了MERS-CoV S蛋白的293T细胞中(50μl)，然后将ADCC效应细胞(promega)25微升(1.5×10⁵个)加入到孔中，37度温育24h后测其luciferase，结果如图1所示，去岩藻糖基化的m336抗体能够显著更有效的诱导表达了MERS-CoV S蛋白的细胞的ADCC作用；

检测Fab与MERS冠状病毒S蛋白的结合能力：

将MERS冠状病毒S蛋白包被在ELISA板上，加入梯度浓度稀释的m336，m336-gH及对照抗体的Fab孵育，用抗FLAG标签抗体来检测Fab与MERS冠状病毒S蛋白的结合能力；图2显示了ELISA结果，m336-gH比m336具有更强的MERS 冠状病毒S蛋白的结合能力；

检测抗体对MERS冠状感病毒中和能力：

将MERS冠状病毒S蛋白基因和表达荧光素酶作为报告基因缺陷的HIV-1基因，共同转染293T细胞，包装MERS-CoV假病毒，将m336，m336-gH和无关抗体m102.4梯度稀释，与假病毒一起感染Huh-7细胞，孵育后检测细胞裂解液luciferase，如图3所示，m336抑制感染中和活性的IC50为0.003ug/mL，m336-gH的IC50为0.002ug/mL，即m336的IC50为m336-gH的1.5倍，m336-gH比m336具有更强的MERS冠状病毒中和能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种去岩藻糖基化全人源单克隆抗体及其应用

<130> 20150825

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

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