本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种定量检测人源化PD-L1抗体的试剂盒，属于生物医药技术领域。
背景技术：
人源化PD-L1抗体能够与部分肿瘤表面PD-L1位点结合，阻断T细胞表面PD-1与肿瘤PD-L1结合，从而解除肿瘤细胞对T细胞免疫抑制作用，增强T细胞杀伤肿瘤细胞能力。现CUSABIO公司已经研发出够检测PD-L1浓度的Humman Programmed Death Ligand-1(PD-L1/CD274)ELISA试剂盒，并且其敏感性已经达到了3.9pg/mL，但随着人们对肿瘤治疗的研究，更多的研究人员从事了PD-L1抗体的开发与研制，现急需一种能够检测PD-L1抗体的方法来评估细胞表达的能力，本发明采用间接ELISA原理，以PD-L1蛋白为包被蛋白捕获样本中人源化PD-L1抗体，并依据标准品绘制的标准曲线计算出样本中人源化PD-L1抗体的浓度。在本发明之前，尚未见定量检测人源化PD-L1抗体试剂盒的相关报道，也未发现定量检测人源化PD-L1抗体试剂盒在科研与生产中应用。
技术实现要素：
为探寻现阶段对人源化PD-L1抗体含量检测的快捷方法，方便从事相关研究人员对其浓度的测定，本发明提供了一种采用PD-L1蛋白包被ELISA板，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体为标记物，放大样本中人源化PD-L1抗体信号，通过标准品绘制标准曲线，根据样本OD值间接得出样品中人源化PD-L1抗体的浓度。
本发明解决其技术问题的技术方案是：一种测定人源化PD-L1抗体浓度的ELISA试剂盒，包括加样板、洗涤浓缩液、标准品、标准品稀释液、酶标抗体、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液。
上述的ELISA试剂盒，其中各种试液的组成及制备方法如下：
加样板的制作：用0.05M碳酸盐缓冲液将人PD-L1蛋白稀释成0.25ug/mL浓度，ELISA板中每孔加入100uL后加盖置于4℃环境中包被14h；将洗涤液加入到加样孔孔中，每孔300uL，洗涤3次，每次5分钟；称取适量BSA(牛血清白蛋白)用洗涤液配成5％的封闭液，加入到加样孔中，每孔300uL，加盖后置于37℃封闭2小时；洗涤液洗涤，每孔300uL，每次5分钟，洗3次；甩去洗涤液，室温晾干后装入铝箔袋放入干燥剂后真空包装，4℃保存。
洗涤浓缩液为：NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g定容至100mL，加入500uL吐温-20，混匀分装入瓶，每瓶20mL，4℃保存。
样本稀释液为：0.01M pH值7.2的PBS缓冲液，配方如下：称取NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸/氢氧化钠调节pH值至7.2后定容至1L，加入500uL吐温-20，混匀，分装入瓶，每瓶30mL。
标准品为:人源化PD-L1抗体冻干粉配方及冻干方法，配方：50g/L BSA、PD-L1抗体250ug/L，分装至小管中，每管1mL，冷冻后真空干燥，拧紧盖子，4℃保存。
酶标抗体稀释液配方为：：用0.01M pH值为7.2～7.4PBS配制2％的BSA溶液，吸取12mL至酶标抗体稀释液瓶中，盖盖密封，4℃保存。
酶标抗体来源：购买自Solarbio公司的羊抗人IgG-HRP(货号SE101)，吸取4uL加入到酶标抗体瓶中，加入100uL酶标抗体稀释液混匀，盖盖密封，4℃保存。
底物显色液为购自Solarbio的TMB底物显色液(货号：PR1200)，分装至棕色瓶内，每瓶10mL，4℃避光保存。
终止液为2M硫酸溶液，配方如下，量取500mL蒸馏水至烧杯中，量取108.7mL浓硫酸(18M)，沿壁缓慢倒入水中，边倒边搅拌，量取200mL蒸馏水冲洗浓硫酸量杯，洗涤液缓慢导入硫酸溶液中，再用100mL蒸馏水洗涤一次，洗涤液倒入硫酸溶液中，冷却至室温后，倒入容量瓶，定容至1000mL，分装到小瓶内，每瓶6mL，室温保存。
根据上述的方法制备得到的ELISA试剂盒，使用方法如下：
1)将洗涤浓缩液瓶中加入180mL的蒸馏水混匀；标准品冻干粉中加入1mL样品稀释液，并作倍比稀释S1～S7，S8为样品稀释液；酶标抗体用酶标抗体稀释液进行120倍稀释，4℃避光保存。
2)打开加样板包装，取出加样板；
3)将待测样品及标准品稀释液加入到加样孔中，每孔100uL，设置1～2平行对照，密封后置于37℃温箱中孵育1h。
4)甩去液体，每孔加入300uL洗涤液，作用5min，重复3次；
5)甩去液体，每孔加入100uL酶标二抗液，密封后置于37℃孵育1h。
6)甩去液体，洗涤，步骤如4)；
7)每孔加入100uLTMB底物显色液，密封后置于37℃温箱显色15～30分钟；
8)每孔加入50uL硫酸终止液，5min中内用酶标仪读取OD450nm值；
9)计算平均数，绘制标准曲线，将样品OD450nm值带入方程，求出浓度。
本发明的有益效果是，本发明ELISA试剂盒采用纯净PD-L1蛋白作为包被抗原，确保样品中人源化PD-L1抗体能够与包被蛋白发生特异性的结合，从而进一步被酶标抗体补获，在这个过程中经历了两次抗原抗体结合的过程，大大提高了检测的特异性；参照标准品倍比稀释测定的OD450nm值-浓度曲线，可以计算出样本内人源化PD-L1抗体浓度，方便研究人员对细胞表达人源化PD-L1抗体水平进行评定。
附图说明
图1为细胞上清中PD-L1抗体标准曲线图
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露内容轻易地了解本发明的具体特点与功效。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的专利保护范围不局限于下述特定的具体实施方案，还应理解实施例中出现的标准品OD450nm时，应理解，由于显色时间的差异，标准品OD450nm值会有浮动，但不影响绘制标准曲线及对样本的测定。
【实施例1】抗原包被板的制备
(1)使用包被液对PD-L1蛋白进行溶解，包被液为：PD-L1蛋白0.25ug/L、Na2CO3 1.59g/L、NaHCO3 2.93g/L，pH值9.6。
(2)在酶标板孔中加入包被溶液，每孔100uL，自封袋密封后置于4℃作用14h。
(3)甩去包被溶液，使用洗涤液进行洗涤，洗涤液为：
NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值＝7.4，洗涤方法为：每孔加入300uL洗涤液，室温静置5min，甩去后每孔再次加入300uL洗涤液，重复3次。
(4)使用封闭液进行封闭，封闭液为：BSA 50g/L，NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值7.4，封闭方法为：每孔加入封闭液300uL，密封后置于37℃温箱中作用2h。
(5)洗涤，方法如(3)，拍干后同干燥剂一起真空封闭入铝箔袋。4℃保存。
【实施例2】细胞转染上清的测定
将人源化PD-L1抗体轻、重链基因重组质粒共转染HEK293细胞，制备人源化PD-L1抗体上清液，加入到孔中，每孔100uL，设置两个个平行孔，用标准品稀释液稀释标准品S1～S7,浓度为250ng/mL、125ng/mL……3.90625ng/mL，S8为标准品稀释液，加入到孔中，每孔100uL，设置一个平行，采用常规ELISA步骤，封闭及洗涤过程液体为300uL，显色20分钟，OD450nm值如表1：
表1标准品稀释液及样品OD450nm值
绘制标准曲线如图1，根据标准曲线方程求出细胞上清中PD-L1抗体浓度为81.584ng/mL。