检测人Lp-PLA2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及检测人Lp-PLA2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。所述试纸通过双抗体夹心法检测人Lp-PLA2蛋白，所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一Lp-PLA2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一Lp-PLA2单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二Lp-PLA2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二Lp-PLA2单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本发明的荧光免疫层析试纸操作简便、快速、检测范围宽、特异性高、灵敏度好。
【专利说明】检测人LP-PLA2蛋白的巧光免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肤化学和免疫学领域，具体涉及人脂蛋白相关磯脂酶A2 (LP-PLA2) 抗原表位肤、用该抗原表位肤制备的LP-PLA2特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗 体、所述抗体在制备人LP-PLA2体外诊断试剂盒上的用途，人LP-PLA2体外诊断试剂盒，W 及一种用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 也脑血管疾病一直被公认为是危害人类健康的最大杀手之一，也是全球范围内造 成死亡的最主要原因。我国每年死于也脑血管疾病的人数高达300万W上，现有患者超过 6000万人。近年来，随着居民生活水平的不断提高，自然环境的不断恶化，各种人群的也脑 血管疾病的患病率、发病率和死亡率都呈逐年上升的趋势。尤其是中老年人的发病率高达 62%，因此预防治疗也脑血管疾病已经变得刻不容缓，它不仅关系到广大人民群众的健康生 活问题，在一定程度上还影响着整个国家国民素质的整体情况。
[0003] 也脑血管疾病的病理基础是动脉粥样硬化。近年来，研究发现动脉粥样硬化是一 种炎性反应性疾病，炎性细胞及其释放的产物被认为是最主要的促动脉粥样硬化的因素。 在粥样斑块形成、进展和最终破裂的过程中均有炎性反应介质的参与。
[0004] 因此，寻找一种能够反应该种动态变化过程的介质尤为重要，目前国际上已经 发现了一种新的炎性反应标志物，即脂蛋白相关磯脂酶A2化ipoprotein-Associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)。
[0005] 脂蛋白相关磯脂酶A2,英文简写LP-PLA2,属于磯脂酶A2家族，主要由炎症细胞 巧口巨瞻细胞和淋己细胞)分泌。LP-PLA2是由441个氨基酸组成的蛋白质，分子量为45KDa。 LP-PLA2具有降解血小板活化因子的活性，又称为血小板活化因子己醜水解酶（PAF-AH)。 80%的LP-PLA2与低密度脂蛋白（LDL)结合，能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磯脂，生成溶 血卵磯脂和氧化型游离脂肪酸，后二者是促炎物质，因此LP-PLA2具有促炎症和促动脉粥 样硬化形成的作用。
[0006] 当动脉粥样硬化的炎症发展到严重程度时，LP-PLA2将会被大量释放入血液中，致 使其血液内的水平大幅增高，因此LP-PLA2在血液中的浓度能够反映动脉粥样斑块的炎症 程度。
[0007] 因此，通过检测血液中的LP-PLA2,可W有效地了解动脉粥样硬化斑块的炎症程度 及其稳定性。该样就可预警也肌梗死和脑血栓的发生，对预防也脑血管突发事件具有相当 重要的意义。
[0008] 检测LP-PLA2最理想的方法是免疫测定。因此，寻找合适的具有免疫原性的 LP-PLA2抗原表位肤、制备特异性的LP-PLA2抗原及抗体即成为了重点。
[0009] 英光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品 检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申 请No. 200910117820. 8公开了一种英光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法； 中国专利申请No. 200910047352. I公开了一种英光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然 而，目前还没有针对人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸。
【发明内容】
[0010] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种用于定量检测待测物中 人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸及其制备方法。
[0011] 具体而言，本发明提供了：
[0012] 一种用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸，该试纸通过双 抗体夹也法检测所述人LP-PLA2蛋白，其中：
[0013] 所述双抗体夹也法采用标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体作为捕获抗 体，所述第一 LP-PLA2单克隆抗体来源于人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的一者；并且
[0014] 所述双抗体夹也法采用第二LP-PLA2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二 LP-PLA2单克隆抗体来源于人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的另一者；
[00巧]所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)分别为：
[0016] (1)Thr-Lys-Ile-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ；
[0017] (2)Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0018] 优选地，所述第一 LP-PLA2单克隆抗体是由第一 LP-PLA2抗原制备而成的，该第一 LP-PLA2抗原是通过使所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的一者与载体蛋白偶联制 备而成的；并且
[0019] 所述第二LP-PLA2单克隆抗体是由第二LP-PLA2抗原制备而成的，该第二LP-PLA2 抗原是通过使所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成 的。
[0020] 优选地，所述英光微球的粒径为320nm至400nm。
[0021] 优选地，所述英光微球上的英光物质为异硫氯酸英光素、四己基罗丹明、四甲基异 硫氯酸罗丹明或X-罗丹明，其中优选为X-罗丹明；所述英光微球的微球材料为聚苯己帰、 聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋的共聚物。
[0022] 优选地，所述英光微球的激发波长为350?600皿，优选为390皿；发射波长为 500 ?700nm，优选为 615nm。
[0023] 优选地，所述英光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向 依次W接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结合垫设置有所述的标记 有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包 被有所述第二LP-PLA2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。
[0024] 优选地，所述反应膜为在大于550nm的波长下基本上不发英光的硝酸纤维素膜。 [00巧]优选地，所述底板基本上不具有英光性质。
[0026] 优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选 为羊抗鼠IgG单克隆抗体。
[0027] 本发明还提供了一种制备所述的用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的英光 免疫层析试纸的方法，其包括W下步骤：
[002引 I)提供标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体；
[0029] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2 单克隆抗体；
[0030] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二LP-PLA2 单克隆抗体和抗抗体，W分别形成检测区和质控区；和
[0031] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述英光免疫层析试纸。
[0032] 优选地，所述步骤1)包括：
[0033] a)用碳二亚胺活化英光微球，优选地，将英光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述英光微球；
[0034] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的英光 微球用N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液洗涂、分散，并经超声波处理；
[00巧]C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 LP-PLA2单克隆抗体，优选地，将步骤b) 所获得的英光微球与第一 LP-PLA2单克隆抗体混合，用BSA-己醇胺缓冲液封闭，离也，用 BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗 体。
[0036] 优选地，在所述步骤2)中，所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体的 包被浓度为0. 5?2mg/ml。
[0037] 优选地，在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间隔3mm至8mm，所述第二 LP-PLA2单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0. 5?2mg/ml。
[0038] 本发明与现有技术相比具有W下优点和积极效果：
[0039] 1.本发明的人LP-PLA2抗原表位肤具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原） 免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0040] 2.用本发明制备的LP-PLA2单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样 本中的LP-PLA2结合。
[0041] 3.本发明的人LP-PLA2体外诊断试剂盒可W有效地监测动脉粥样硬化斑块的炎 症程度及其稳定性，可预警也肌梗死和脑血栓的发生，预防也脑血管突发事件。
[0042] 4.本发明将英光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测 待测物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人LP-PLA2蛋白， 操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，能 够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。
[0043] 5.本发明在制备所述人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸的过程中，通过大量的 试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的英光免疫层析试纸进行检测时，英光 信背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测区 与质控区的英光强度比值的变化来反应样品中LP-PLA2的含量，该与传统的层析技术只考 查检测区的绝对英光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高 了检测结果可信度。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 图I示意性示出本发明的一个实施方案的英光免疫层析试纸的结构示意图。
【具体实施方式】
[0045] W下通过【具体实施方式】的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但该并非是对 本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可W做出各种修改或改进，但是只 要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0046] 一、人LP-PLA2抗原表位肤
[0047] 本文中所述的人LP-PLA2蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的， 可W在NCBI等专业数据库中查到。
[004引本发明提供了一种人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)，其氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，为：
[0049] (1)T虹-Lys-IIe-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ;
[0050] (2)Tyr-LyS-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0051] 本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的 抗原性的抗原表位肤。
[0052] LP-PLA2抗原表位肤（1) W人LP-PLA2蛋白N端第54至62位的一段含9个氨基 酸残基的肤段为抗原决定簇，并且在其C端添加有亲水性肤段Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr, 该样构成的LP-PLA2抗原表位肤（1)具有亲水性高、抗原性强并且易于合成的特点。
[0053] LP-PLA2抗原表位肤（2) W人LP-PLA2蛋白C端第372至385位的一段含14个氨 基酸残基的肤段为抗原决定簇，并且在其N端添加有Tyr。在N端添加Tyr是为了使该抗原 表位肤通过抓B (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到载体蛋白（例如血蓝蛋白 (KLH))上，从而作为抗原来制备抗体。LP-PLA2抗原表位肤（2)也具有亲水性高、抗原性强 并且易于合成的特点。
[0054] 目前，本发明研究发现，本发明的LP-PLA2抗原表位肤具有如下功能：
[0055] 1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体； 3.用抗原表位肤制备的抗体可特异性地与人LP-PLA2结合。
[0056] 本发明的LP-PLA2抗原表位肤的制备方法可用化学合成法；利用美国ABI431A型 多肤自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肤。本发明的抗原表位肤（1)和（2)的分子量 分别为1690. 09和1623. 92,可用质谱进行确定，并通过多肤序列测定鉴定所合成的抗原表 位肤序列。肤段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肤的浓度。
[0057] 二、LP-PLA2 抗原
[0058] 本发明还提供了一种LP-PLA2抗原，其通过使本发明的人LP-PLA2抗原表位肤（1) 和（2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了 LP-PLA2抗原（1)和 (2)，所述LP-PLA2抗原（1)通过使本发明的人LP-PLA2抗原表位肤（1)与载体蛋白偶联制 备而成；所述LP-PLA2抗原（2)通过使本发明的人LP-PLA2抗原表位肤（2)与载体蛋白偶 联制备而成。本发明的LP-PLA2抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动 物从而制备特异性的LP-PLA2抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血 蓝蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结 合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉 反应，因此是优选的。
[0059] H、LP-PLA2单克隆抗体、LP-PLA2多克隆抗体和人LP-PLA2体外诊断试剂盒
[0060] 本发明还提供了人LP-PLA2单克隆抗体和人LP-PLA2多克隆抗体，所述抗体可W 分别利用本发明的LP-PLA2抗原（1)和（2)(免疫原）免疫动物制备而得。制备方法可采 用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。
[0061] 本发明的LP-PLA2单克隆抗体和多克隆抗体可W用于制备人LP-PLA2体外诊断试 剂盒，该试剂盒可W基于免疫方法对血液标本中的LP-PLA2进行检测。
[0062] 因此，本发明提供了一种人LP-PLA2体外诊断试剂盒，其包含本发明的人LP-PLA2 单克隆抗体或多克隆抗体。
[0063] 目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括W下几种；ELISA法、化学发 光法、英光层析法、胶体金免疫测定法等。
[0064] 而化ISA法包括W下几种类型；双抗体夹也法检测抗原、双抗原夹也法检测抗体、 间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
[0065] 本发明的人LP-PLA2体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹也法来检测 LP-PLA2蛋白。该试剂盒可W包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工 具和试剂等。
[0066] 优选的是，所述人LP-PLA2体外诊断试剂盒采用本发明的人LP-PLA2单克隆抗体 作为包被抗体。在此，术语"包被抗体"是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人 LP-PLA2体外诊断试剂盒还优选包含人LP-PLA2多克隆抗体W作为结合抗体，其中，当所述 结合抗体来源于本发明的人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的一者时，所述包被抗体来 源于所述抗原表位肤（1)和（2)中的另一者。在此，术语"结合抗体"是指试剂盒中可与待 测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可W包含酶标记的第二抗体， 该第二抗体可W为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可W为辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等。
[0067] 用本发明的人LP-PLA2体外诊断试剂盒进行临床研究，对115例病人和79例对照 组血样标本进行检测，检测灵敏度为93%，特异度为91%，准确性为92%。
[0068] 基于此结果可W得知，利用本发明的LP-PLA2抗体制备的人LP-PLA2体外诊断试 剂盒能够监测动脉粥状硬化的炎症程度，对于也肌梗塞和脑血栓的发生具有相当重要的预 警作用。
[0069] 在本发明的试剂盒中，还可W包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗 涂液、显色剂、终止液等。
[0070] 四、用于定量检测人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试纸
[0071] 本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫层析试 纸，该试纸通过双抗体夹也法检测所述人LP-PLA2蛋白，其中：
[0072] 所述双抗体夹也法采用标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体作为捕获抗 体，所述第一 LP-PLA2单克隆抗体来源于人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的一者；并且
[0073] 所述双抗体夹也法还采用第二LP-PLA2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二 LP-PLA2单克隆抗体来源于人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的另一者；
[0074] 所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)分别为：
[0075] (1)Thr-Lys-Ile-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ；
[0076] (2)Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0077] 在本发明中，在双抗体夹也法英光免疫层析试纸中，"捕获抗体"是指能够首先特 异性识别待测抗原的抗体，其通常设置在结合垫上；"检测抗体"是指另一种能够特异性识 别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别识别待测抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反应膜的检测区上。
[0078] 在本发明中，所述第一 LP-PLA2单克隆抗体可W由第一 LP-PLA2抗原制备而成，该 第一 LP-PLA2抗原可W通过使所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的一者与载体蛋白 偶联制备而成；并且所述第二LP-PLA2单克隆抗体可W由第二LP-PLA2抗原制备而成，该第 二LP-PLA2抗原可W通过使所述人LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)中的另一者与载体蛋白 偶联制备而成。
[0079] 在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH (钥孔血蓝蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结合位点多，免疫效果较 好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0080] 优选地，本发明的英光免疫层析试纸中所用的英光微球的粒径为320nm至400nm， 优选为360nm，英光微球上的英光物质可为异硫氯酸英光素、四己基罗丹明、四甲基异硫氯 酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明（可购自上海晶纯公司）。英光微球的微球 材料可W为由聚苯己帰、聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋与其它单体共聚形成的共聚 物，其它单体的例子为苯己帰等。英光微球的激发波长可W为350?600nm，优选为390nm ; 发射波长可W为500?700皿，优选为615皿。
[0081] 在本发明中，英光微球的最大激发波长与发射波长差值较大，说明英光微球有较 大的斯巧克斯（Stokes)位移，该样，英光试纸的背景干扰较低，W该微球做免疫层析标记物 有较强的优势。
[0082] 在一个具体的实施方案中，本发明的英光免疫层析试纸具有底板，并且在该底 板上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸， 所述样品垫用于在使用时加载待测样品，所述结合垫设置有所述的标记有英光微球的第 一 LP-PLA2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二 LP-PLA2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克 隆抗体特异性结合的抗抗体。
[0083] 优选地，本发明的英光免疫层析试纸的样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸可W沿 使用时的层析方向依次搭接设置在底板上(参见图1)。反应膜上间隔设置的检测区和质控 区可W为，但不限于，线、带、块等形式，检测区和质控区优选间隔3mm至8mm。
[0084] 在本发明中，反应膜优选为在大于550nm的波长下基本上不发英光的硝酸纤维素 膜。此外，底板优选基本上不具有英光性质。
[0085] 通常，常规的层析试纸组件(反应膜、底板等)在550nm波长下具有较明显的英光背 景，该对英光信号的检测产生很大干扰。本发明通过采用在大于550nm的波长下基本上不 发英光的硝酸纤维素膜和低英光性质的底板，从而克服了常规英光试纸的缺陷。此外，本发 明所用的英光物质X-罗丹明可产生较强的英光信号，从而进一步大大提高了英光信背比， 使得能够很好地区分信号和背景，进而提高检测灵敏度。
[0086] 在本发明中，样品垫和结合垫的材料可采用本领域通常使用的材料，例如，样品垫 和结合垫可W为玻璃纤维。
[0087] 本发明所采用的能与标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体特异性结合的 抗抗体可W为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单 克隆抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体特异性更高。
[0088] 在一个具体的实施方案中，本发明的英光免疫层析试纸在使用时，在样品垫上滴 加样品液巧日含有LP-PLA2的血样)，在毛细管作用下，样品液向吸水滤纸一端移动，在结合 垫处与所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体形成免疫复合物，该免疫复合物 进一步移动，在检测线上与所述第二LP-PLA2单克隆抗体结合形成双抗体夹也的免疫复合 物，而未形成免疫复合物的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体则与质控线上的抗 抗体结合。此过程需要10分钟至15分钟，之后，用英光检测仪进行检测，如果质控线处未出 现条带，则说明试纸失效；如果质控线处出现条带，而检测线处未出现条带，则说明样品中 不含人LP-PLA2蛋白；如果在质控线和检测线上均出现条带，则说明样品中含有人LP-PLA2 蛋白。
[0089] 在另一个方面，本发明提供了一种制备用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的 英光免疫层析试纸的方法，其包括W下步骤：
[0090] 1)提供标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体；
[0091] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2 单克隆抗体；
[0092] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二LP-PLA2 单克隆抗体和抗抗体，W分别形成检测区和质控区；和
[0093] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述英光免疫层析试纸。
[0094] 本领域技术人员可W理解的是，可W根据实际需要对上述步骤的顺序进行调整， 例如步骤3)可W在步骤1)之前，或在步骤1)和2)之间。
[0095] 本发明的方法还可W包括将制成的英光免疫层析试纸切割成适当宽度的步骤5)。
[0096] 本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人LP-PLA2 蛋白的英光免疫层析试纸的方法的各个步骤的条件，从而使得本发明的英光免疫层析试纸 能够针对人LP-PLA2蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，检测范围宽、特异性高、灵敏 度好。
[0097] 因此，优选的是，在本发明的方法中，所述步骤1)包括：
[0098] a)用碳二亚胺活化英光微球，优选地，将英光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述英光微球；
[0099] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的英光 微球用N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液洗涂、分散，并经超声波处理；
[0100] C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 LP-PLA2单克隆抗体，优选地，将步骤b) 所获得的英光微球与第一 LP-PLA2单克隆抗体混合，用BSA-己醇胺缓冲液封闭，离也，用 BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗 体。
[0101] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述步骤1)包括：
[0102] a)用碳二亚胺活化英光微球，其中，取I (w/v) %的英光微球水分散液，10000巧m至 15000巧m低温(例如IOC )离也5至10分钟，去上清，将沉淀物分散到500 y 1的蒸觸水或 初洗缓冲液（0. IM的MES水溶液）中，超声波（240W)处理1至2分钟，重复W上过程H次， 加入碳二亚胺IOmg至50mg，揽拌10?15分钟，从而活化所述英光微球；
[0103] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，其中，将步骤a)所获得的活化的英光 微球在1000巧m至1500化pm下离也5至10分钟，将沉淀物分散到Iml偶联缓冲液（20? IOOmM的N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液)）中，超声波（240W)处理1至2分钟，重 复W上过程H次；
[0104] C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 LP-PLA2单克隆抗体，其中，按照1 至 3 y 1抗体（lOmg/ml) /100 y 1所述活化的英光微球的比例，将步骤b)所获得的英光微球与 第一 Lp-PLA2单克隆抗体混合，室温（25°C )下揽拌1. 5?3小时(优选2小时)，加入Iml封 闭缓冲液（1 (w/v)%BSA-〇. 05M己醇胺)，继续揽拌1小时，在10000巧m至15000巧m下离也5 至10分钟，重复离也3次，将沉淀物分散到500 y 1终洗缓冲液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) % 吐温水溶液）中，超声波（240W)处理I至2分钟，用所述终洗缓冲液定容至500 y 1。
[0105] 优选地，在本发明的方法中，所述步骤2)包括；将标记有英光微球的第一 LP-PLA2 单克隆抗体用抗体稀释液（l%(w/v)BSA-〇. OlMPBS (抑7. 2)缓冲液）进行稀释，W稀释至 0. 5?2mg/ml，优选为Img/ml，然后用微量移液器均匀喷涂在结合垫上，之后烘干或真空冷 冻干燥。在本发明的方法的步骤2)中，所述的标记有英光微球的第一 LP-PLA2单克隆抗体 的包被浓度为0. 5?2mg/ml，优选为1. 5mg/ml。
[0106] 优选地，所述步骤3)包括；用喷金机将所述第二LP-PLA2单克隆抗体和抗抗体划 到硝酸纤维素膜（固相载体）上W作为检测区和质控区，使检测区和质控区的间隔为3mm至 8mm，所述第二Lp-PLA2单克隆抗体和所述抗抗体的浓度分别为0. 5?2mg/ml，优选为Img/ ml O
[0107] 优选地，结果检测利用专用的英光检测仪(可购自深圳市安群生物工程有限公司， 型号AQ-3000)对质控区和检测区进行检测，检测区与质控区英光强度的比值和待测样品中 的LP-PLA2的含量成正比。采用检测区与质控区英光强度的比值而不是直接采用检测区的 绝对英光值可尽可能地减少反应条件、基质等的影响，并尽量避免背景干扰。
[010引 W下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但该些例子不应被理解为 对本发明的保护范围的限制。
[0109] 实施例
[0110] 除非另有说明，W下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。
[01川实施例1 ;Lp-PLA2抗原表位肤（1)和（2)的制备。
[0112] 制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肤自动合成仪，通过固相法分别 合成LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)。抗原表位肤的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定 肤段的浓度。本发明的抗原表位肤（1)和（2)的分子量分别为1690. 09U623. 92,利用质谱 进行确定，通过多肤序列测定鉴定所合成的多肤序列。
[0113] 一、LP-PLA2抗原表位肤（1)和（2)的合成
[0114] 上述肤段采用固相法合成。固相肤合成的主要思想是：先将所要合成肤链的駿基 末端氨基酸的駿基W共价键形式同一个不溶性的高分子化合物（树脂）相连接，然后W此 结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化駿基组份 反应，接长肤链。该样的步骤可W反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肤链的长 度。该个合成过程如下所示。
【权利要求】
1. 一种用于定量检测待测物中人LP-PLA2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗 体夹心法检测所述人Lp-PLA2蛋白，其中 ： 所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一 Lp-PLA2单克隆抗体作为捕获抗体，所 述第一 Lp-PLA2单克隆抗体来源于人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且 所述双抗体夹心法采用第二Lp-PLA2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二Lp-PLA2单 克隆抗体来源于人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者； 所述人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)分别为： (1) Thr-Lys-Ile-Pr〇-Arg-Gly-Asn-Gly-Pr〇-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ； (2) Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn_Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn〇
2. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述第一 Lp-PLA2单克隆抗体是由 第一 Lp-PLA2抗原制备而成的，该第一 Lp-PLA2抗原是通过使所述人Lp-PLA2抗原表位肽 (1)和（2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且 所述第二Lp-PLA2单克隆抗体是由第二Lp-PLA2抗原制备而成的，该第二Lp-PLA2抗 原是通过使所述人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成 的。
3. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的粒径为320nm至 400nm〇
4. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球上的荧光物质为异硫 氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明，其中优选为X-罗丹明；所 述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
5. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的激发波长为350? 600nm，优选为390nm ;发射波长为500?700nm，优选为615nm。
6. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述试纸具有底板，并且在该底板 上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结 合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一 Lp-PLA2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和 质控区，所述检测区包被有所述第二Lp-PLA2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的 标记有荧光微球的第一 Lp-PLA2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。
7. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述反应膜为在大于550nm的波长 下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜。
8. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述底板基本上不具有荧光性质。
9. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述抗抗体为羊抗鼠 IgG单克隆抗 体或兔抗鼠 IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠 IgG单克隆抗体。
10. -种制备根据权利要求1至9中任意一项所述的荧光免疫层析试纸的方法，其包括 以下步骤： 1) 提供标记有突光微球的第一 Lp-PLA2单克隆抗体； 2) 提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一 Lp-PLA2单克 隆抗体； 3) 提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二Lp-PLA2单克 隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；和 4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应 膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤1)包括： a) 用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经 超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球； b) 洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球 用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理； c) 用步骤b)所获得的荧光微球标记第一 Lp-PLA2单克隆抗体，优选地，将步骤b)所 获得的荧光微球与第一 Lp-PLA2单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用 BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一 Lp-PLA2单克隆抗 体。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中在所述步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第 一 Lp-PLA2单克隆抗体的包被浓度为0. 5?2mg/ml。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间 隔3mm至8_，所述第二Lp-PLA2单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0. 5?2mg/ ml〇
【文档编号】G01N33/577GK104237517SQ201310242801
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月18日 优先权日:2013年6月18日
【发明者】朱建安 申请人:深圳市安群生物工程有限公司