专利名称：IgY免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物抗病毒抗菌IgY免疫球蛋白的纯化方法，联 用PEG沉淀法、氯仿抽提法和凝胶层析法。
背景技术：
—般来说，用特异性抗原免疫母鸡并经免疫应答后，即可从其鸡蛋卵黄中不断获 得特异性的免疫球蛋白抗体(Immunoglobulin of egg yolk， IgY)，该免疫球蛋白抗体类似 于单克隆抗体的无限性，又因其抗体来源于同一个体，故抗体的均一性也类似于单克隆抗 体。此外，IgY抗体的纯度高，特异性强，不会象其他哺乳动物产生的抗体那样会发生交叉 血清反应或过敏反应，因而它是最安全的生物制剂。 目前IgY免疫球蛋白的纯化一般是先通过PEG沉淀、氯仿抽提、水稀释和冻融等方 法进行抗体粗提后，再经过超滤、离子交换层析、亲和层析等精细纯化。上海交大李荣秀和 刘浩然发明的IgY的仿生亲和纯化方法是利用基础层析介质合成一种仿生亲和分离材料 制备成亲和层析柱进行卵黄抗体的分离纯化。而本专利是联用PEG沉淀、氯仿抽提进行抗 体粗提后再通过凝胶色谱层析进行精细纯化，成本低廉，纯化时间短，可适合大规模操作。
发明内容
本发明是联用PEG沉淀和氯仿抽提对卵黄抗体进行粗提后再过凝胶色谱柱来纯 化生物抗病毒抗菌IgY免疫球蛋白。该纯化方法成本低、周期短、效果好，可适合大规模、大 批量快速、简便分离纯化免疫球蛋白。 该IgY免疫球蛋白是一种应用抗体工程的被动免疫技术，从免疫后的特种良种鸡 的卵黄中提取的一种免疫球蛋白，具有抗体效价高、专一性强(只杀灭致病菌)、不会产生 交叉血清或过敏反应、均一性好等优点，以及卵黄抗体稳定性好，不会产生使用抗生素、消 炎酶类出现的弊病。 本发明是通过以下技术方案实现的，以传统方法对卵黄抗体进行粗提分离后，直 接上凝胶色谱柱纯化，具有前处理操作简单、纯化快速、抗体纯度和活性高等特点。
本发明包括以下步骤
(1) IgY卵黄抗体的粗提 卵黄中约含有30%的脂类，多以脂蛋白的形式存在，所以要选择合适的方法去除 杂蛋白。聚乙二醇(PEG)是非离子型水溶性聚合物，有很强的亲水性，适合IgY水溶性蛋白 的分离提取，沉淀时间短，不影响离心处理，且即使高浓度也不引起蛋白质变性。再加上氯 仿抽提，能够比较彻底的去除脂类，而且上清液比较澄清透明，抗体回收率高。所以本发明 联用聚乙二醇沉淀和氯仿抽提对IgY卵黄抗体进行粗提。
(2)凝胶层析纯化IgY卵黄抗体 粗提的抗体沉淀用适量pH 7. 4PBS溶解，直接上S印hadex G-75柱子。 (3)IgY卵黄抗体纯度的测定 通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯化后抗体的纯度。
(4) IgY卵黄抗体杀菌性能测定 将纯化后的IgY卵黄抗体与适当浓度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共同倒平板 培养，通过抑菌圈的大小检测IgY抗体的杀菌性能。
具体实施例方式
实施例1粗提IgY卵黄抗体 取蛋黄(去除蛋清和蛋黄膜)，边搅拌边加入4% PEG6000，体积为蛋黄体积的3 倍，当还剩余100ml PEG6000时，加入1/4蛋黄体积的氯仿，在继续缓慢速度搅拌条件下加 入剩余的PEG6000。以6000rpm， l(TC离心10分钟，上清液用纱布过滤后，边搅拌边滴加体 积为上清液0. 3倍的40% PEG6000，再以6000rpm， l(TC离心10分钟，弃上清，用蒸馏水冲洗 4-5遍所得沉淀即为粗提抗体。
实施例2凝胶层析纯化IgY卵黄抗体 将上述粗提分离的抗体沉淀用适量pH7.4PBS溶解，直接上S印hadex G_75柱子过 滤。用pH7. 40. Olmol/L PBS洗脱，流速为0. 3ml/min，上样量3_5ml。
实施例3纯化后IgY卵黄抗体纯度的测定 凝胶层析收集IgY纯品，进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，分离胶浓度为15%，浓縮 胶为5%，电泳时电压分别为110V和80V。上样量约为20iU。考马斯亮蓝染色2h，摇床脱 色。 实施例4纯化后IgY卵黄抗体杀菌性能试验 取两份5mlPBS溶解的上述IgY卵黄抗体分别加入到100 y 1的适当浓度的大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌的悬液里，混合均匀，加15ml 40 50°C PDA液体培养基置于灭菌平皿 里33 35t:培养箱中培养24h。菌落结果显示IgY卵黄抗体对大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌均有很好的抑制效果，抑制率分别为95. 8%和99%以上。
权利要求
一种卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征在于经过PEG沉淀和氯仿抽提后，将上述粗提的抗体沉淀经PBS溶解后直接上凝胶色谱柱。对纯化后的IgY免疫球蛋白进行纯度和杀菌性能测定。
2. 根据权利要求l所述的卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征是，第一步粗提过程为取蛋黄(去除蛋清和蛋黄膜)，加入PEG6000搅拌，可以去除卵黄中的脂蛋白。同时使用氯仿抽提，即加入1/4蛋黄体积的氯仿，充分搅拌混合均匀后，离心取上清。
3. 根据权利要求1所述的卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征是，第二步凝胶层析过程为根据溶质分子在流动相溶剂中的体积大小不同而达到分离的目的，我们将上述分离的IgY抗体经PBS稀释后直接上S印hadex G_75柱子。通过凝胶色谱层析后可以得到高纯度的IgY抗体。
4. 根据权利要求1所述的卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征是，经过抗体粗提和凝胶色谱层析后，对纯化的IgY抗体进行纯度和杀菌性能测定。
5. 根据权利要求4所述的卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征是，通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯化后抗体的纯度。
6. 根据权利要求4所述的卵黄免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法，其特征是，取适量的此IgY卵黄抗体与适当浓度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共同倒平板培养，通过抑菌圈的大小检测IgY抗体的杀菌活性。
全文摘要
本发明涉及一种生物抗病毒抗菌IgY免疫球蛋白抗体的纯化方法。包括以下步骤(1)联用PEG(聚乙二醇，polythylene glycol)沉淀和氯仿抽提对IgY卵黄抗体进行粗提，去除卵黄中的杂蛋白和脂肪；(2)将上述粗提的抗体沉淀进行凝胶色谱纯化；(3)对纯化后的IgY卵黄抗体进行纯度和杀菌性能测定，纯度为99％，对大肠杆菌的抑制率为95.8％，对金黄色葡萄球菌的抑制率为99％以上。
文档编号C07K1/30GK101698680SQ200910041330
公开日2010年4月28日 申请日期2009年7月22日 优先权日2009年7月22日
发明者赵肃清, 陈文彪 申请人:广东京豪医药科技开发有限公司