检测人pgi蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及检测人PGI蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。所述试纸通过双抗体夹心法检测人PGI蛋白，所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一PGI单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一PGI单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二PGI单克隆抗体作为检测抗体，所述第二PGI单克隆抗体来源于序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本发明的荧光免疫层析试纸操作简便、快速、检测范围宽、特异性高、灵敏度好。
【专利说明】检测人PGI蛋白的巧光免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肤化学和免疫学领域，具体涉及人胃蛋白酶原I (PGI)抗原表位肤、 用该抗原表位肤制备的PGI特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制 备人PGI体外诊断试剂盒上的用途，人PGI体外诊断试剂盒，W及一种用于定量检测待测物 中人PGI蛋白的英光免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 胃蛋白酶原（PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体。人胃蛋白酶原按其电泳迁移 率由快至慢，可分为PG1至PG7走种同工酶原，并且根据其生化性质、免疫原性、细胞来源W 及组织内分布可分为PGI和PGII两个亚群。走种同工酶原中的PG1至PG5免疫原性近似， 称为胃蛋白酶原I (PGI)，其主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；PG6至PG7被称为胃 蛋白酶原II (PGII)，除了由胃体和胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细 胞、赏口腺和胃窦的幽口腺的黏液细胞W及十二指肠上段的化unner腺也能产生PGII。胃 几乎是PG的唯一来源，并且在分泌阶段的分泌量会发生变化。血清PGI和PGII反映了胃 粘膜不同部位的分泌功能。合成后的PG大部分进入胃腔，在酸性胃液作用下活化成胃蛋白 酶，只有少量PG (约1%)透过胃黏膜毛。因此，血清PG浓度可W反映其分泌水平。正常人 血清中的PGI是PGII的6倍，当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之发生改变。
[0003] 血清PG含量与幽口螺杆菌（HP)感染、慢性胃炎、胃癌等相关。在不同胃部疾病中， 血清PGI、PGII和PGI/PGII的值发生相应变化，其升高、降低还是不变并不一致，作为诊断 或治疗结果指标的灵敏度和特异度也各不相同。因此，对于不同胃部疾病，血清PGI、PGII 和PGI/PGII的值也有不同的判断标准。
[0004] PGI是检测胃泌酸腺（胃底腺）细胞功能的指针，胃酸分泌增多，则PGI升高；胃酸 分泌减少或胃粘膜腺体萎缩，则PGI降低。例如，在胃酸分泌过多的浅表性胃炎和幽口螺 杆菌（HP)感染的胃炎中，PGI的分泌会增加；而在慢性严重萎缩性胃炎中，当主细胞减少时 PGI含量下降。高浓度的PGI还作为十二指肠溃瘍及并发症危险性的亚临床指征，并且还可 W作为观察HP感染(幽口螺杆菌）根除治疗疗效的一个指标。
[0005] 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率居各种恶性肿瘤之首，其早期诊断、早 期治疗成为提高患者生存质量、降低病死率的唯一途径。国内外学者对胃癌患者血清PG变 化作了大量的研究发现；当患胃癌时，血清PGI水平降低，PGII水平基本保持正常或升高， 进而，测定血清PGI的水平和PGI/PGII的比值有助于胃癌的鉴别诊断，过低的PGI和PGI/ PGII应警惕早期胃癌。由于血清PG的含量直接反映胃黏膜的功能，因此胃癌患者血清PGI 水平明显下降，表明胃癌患者胃黏膜分泌能力下降。80% W上的胃癌伴有萎缩性胃炎，而萎 缩性胃炎可导致胃黏膜主细胞丢失，从而影响其分泌功能；胃癌患者血清PGI水平明显下 降与胃癌患者胃黏膜萎缩、肠化从而分泌降低有关。因此血清PGI及PGI/PGII明显下降对 监测早期胃癌具有重要的临床意义，可有效应用于胃癌高发区人群的初步筛查。PG检测作 为非侵入性方法，可降低胃病患者或胃癌高危人群检查的痛苦，并且简便、经济，具有重大 意义。
[0006] 检测血清中的PGI水平的最理想的方法是免疫测定。因此，寻找合适的具有免疫 原性的PGI抗原表位肤、制备特异性的PGI抗原及抗体即成为了重点。
[0007] 英光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品 检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申 请No. 200910117820. 8公开了一种英光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法； 中国专利申请No. 200910047352. 1公开了一种英光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然 而，目前还没有针对人PGI蛋白的英光免疫层析试纸。
【发明内容】
[0008] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种用于定量检测待测物中 人PGI蛋白的英光免疫层析试纸及其制备方法。
[0009] 具体而言，本发明提供了：
[0010] 一种用于定量检测待测物中人PGI蛋白的英光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体 夹也法检测所述人PGI蛋白，其中：
[0011] 所述双抗体夹也法采用标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体作为捕获抗体，所 述第一 PGI单克隆抗体来源于人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的一者；并且
[0012] 所述双抗体夹也法采用第二PGI单克隆抗体作为检测抗体，所述第二PGI单克隆 抗体来源于人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的另一者；
[001引所述人PGI抗原表位肤（1)和（2)分别为：
[0014] (1)Tyr-Lys-Val-Pro-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ;
[00 巧] (2)Tyr-Lys-Asn-Phe-T虹-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln。
[0016] 优选地，所述第一 PGI单克隆抗体是由第一 PGI抗原制备而成的，该第一 PGI抗原 是通过使所述人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且
[0017] 所述第二PGI单克隆抗体是由第二PGI抗原制备而成的，该第二PGI抗原是通过 使所述人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。
[001引优选地，所述英光微球的粒径为320皿至400皿。
[0019] 优选地，所述英光微球上的英光物质为异硫氯酸英光素、四己基罗丹明、四甲基异 硫氯酸罗丹明或X-罗丹明，其中优选为X-罗丹明；所述英光微球的微球材料为聚苯己帰、 聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋的共聚物。
[0020] 优选地，所述英光微球的激发波长为350?600皿，优选为390皿；发射波长为 500 ?700nm，优选为 615nm。
[0021] 优选地，所述英光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向 依次W接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结合垫包被有所述的标记 有英光微球的第一 PGI单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有 所述第二PGI单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有英光微球的第一 PGI单克 隆抗体特异性结合的抗抗体。
[0022] 优选地，所述反应膜为在大于550nm的波长下基本上不发英光的硝酸纤维素膜。
[0023] 优选地，所述底板基本上不具有英光性质。
[0024] 优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选 为羊抗鼠IgG单克隆抗体。
[0025] 本发明还提供了一种制备所述的用于定量检测待测物中人PGI蛋白的英光免疫 层析试纸的方法，其包括W下步骤：
[0026] 1)提供标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体；
[0027] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有英光微球的第一 PGI单克 隆抗体；
[0028] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二PGI单克 隆抗体和抗抗体，W分别形成检测区和质控区；和
[0029] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述英光免疫层析试纸。
[0030] 优选地，所述步骤1)包括：
[0031] a)用碳二亚胺活化英光微球，优选地，将英光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述英光微球；
[0032] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的英光 微球用N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液洗涂、分散，并经超声波处理；
[0033] C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 PGI单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获 得的英光微球与第一 PGI单克隆抗体混合，用BSA-己醇胺缓冲液封闭，离也，用BSA-吐温 水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体。
[0034] 优选地，在所述步骤2)中，所述的标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体的包被 浓度为0. 5?2mg/ml。
[003引优选地，在所述步骤3 )中，所述检测区和所述质控区间隔3mm至8mm，所述第二PGI 单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0. 5?2mg/ml。
[0036] 本发明与现有技术相比具有W下优点和积极效果：
[0037] 1.本发明的人PGI抗原表位肤具有良好的抗原性，用其制备的抗原娩疫原)免疫 动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0038] 2.用本发明制备的PGI单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中 的PGI结合。
[0039] 3.本发明的人PGI体外诊断试剂盒可W有效地监测血清中的PGI的水平，并且制 备方法简单，成本低，适于规模化生产。
[0040] 4.本发明将英光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测 待测物中人PGI蛋白的英光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人PGI蛋白，操作简 便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，能够迅速 及时地帮助诊断病情，监测预后。
[0041] 5.本发明在制备所述人PGI蛋白的英光免疫层析试纸的过程中，通过大量的试验 摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的英光免疫层析试纸进行检测时，英光信背 比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测区与质 控区的英光强度比值的变化来反应样品中PGI的含量，该与传统的层析技术只考查检测区 的绝对英光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高了检测结 果可信度。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1为示出本发明的人PGI体外诊断试剂盒的检测结果与已知试剂盒的检测结果 的相关性的图，其中横坐标为用已知试剂盒测得的样品中PGI浓度的值，单位为ng/ml，纵 坐标为用本发明试剂盒测得的样品中PGI浓度的值，单位为ng/ml。
[0043] 图2示意性示出本发明的一个实施方案的英光免疫层析试纸的结构示意图。
【具体实施方式】
[0044] W下通过【具体实施方式】的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但该并非是对 本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可W做出各种修改或改进，但是只 要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0045] -、人PGI抗原表位肤
[0046] 本文中所述的人PGI蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可W 在NCBI等专业数据库中查到。
[0047] 本发明提供了一种人PGI抗原表位肤（1)和（2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，为：
[0048] (l)Y-K-V-PA-I-R-K-K-SA-R-R ;和
[0049] (2) Y-K-N-F-T-V-F-D-R-A-N-N-Qo
[0050] 本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，筛选得到两个具有良好的抗原 性的抗原表位肤。
[0051] PGI抗原表位肤（1) W人PGI蛋白（PG3)N端第19至30位的一段含12个氨基酸 残基的肤段作为抗原决定簇，并且在其N端添加有Y。在N端加Y是为了使该抗原表位肤 通过抓B (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到载体蛋白（例如血蓝蛋白（KLH)) 上，从而作为抗原来制备抗体。PGI抗原表位肤（1)具有亲水性高、抗原性强并且易于合成 的特点。
[0052] PGI抗原表位肤（2) W人PGI蛋白（PG3)C端第372至381位的一段含10个氨基 酸残基的肤段作为抗原决定簇，并且在其N端添加有3个氨基酸残基；Y、K、N。该样构成的 PGI抗原表位肤（2)也具有亲水性高、抗原性强并且易于合成的特点。
[0053] 目前，本发明研究发现，本发明的PGI抗原表位肤具有如下功能：
[0054] 1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体； 3.用抗原表位肤制备的抗体可特异性地与人PGI结合。
[00巧]本发明的PGI抗原表位肤的制备方法可用化学合成法；利用美国ABI431A型多肤 自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肤。本发明的抗原表位肤（1)和（2)的分子量分别 为1657. 24和1616. 93,可用质谱进行确定，并通过多肤序列测定鉴定所合成的抗原表位肤 序列。肤段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肤的浓度。
[005引 二、PGI抗原
[0057] 本发明还提供了一种PGI抗原，其通过使本发明的人PGI抗原表位肤（1)和（2)中 的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了 PGI抗原（1)和（2)，所述PGI 抗原（1)通过使本发明的人PGI抗原表位肤（1)与载体蛋白偶联制备而成；所述PGI抗原 (2)通过使本发明的人PGI抗原表位肤（2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的PGI抗原 具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的PGI抗体。在本 发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH (钥孔血蓝蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白 OVA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动 物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0058] H、PGI单克隆抗体、PGI多克隆抗体和人PGI体外诊断试剂盒
[0059] 本发明还提供了人PGI单克隆抗体和人PGI多克隆抗体，所述抗体可W分别利用 本发明的PGI抗原（1)和（2)(免疫原）免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常 规技术，具体可参见实施例2。
[0060] 本发明的PGI单克隆抗体和多克隆抗体可W用于制备人PGI体外诊断试剂盒，该 试剂盒可W基于免疫方法对血液标本中的PGI进行检测。
[0061] 因此，本发明提供了一种人PGI体外诊断试剂盒，其包含本发明的人PGI单克隆抗 体或多克隆抗体。
[0062] 目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括W下几种；ELISA法、化学发 光法、英光层析法、胶体金免疫测定法等。
[0063] 而化ISA法包括W下几种类型；双抗体夹也法检测抗原、双抗原夹也法检测抗体、 间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
[0064] 本发明的人PGI体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹也法来检测PGI蛋白。 该试剂盒可W包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。
[0065] 优选的是，所述人PGI体外诊断试剂盒采用本发明的人PGI单克隆抗体作为包被 抗体。在此，术语"包被抗体"是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人PGI体外 诊断试剂盒还优选包含人PGI多克隆抗体W作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于 本发明的人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肤 (1)和似中的另一者。在此，术语"结合抗体"是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二 抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可W包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可W为羊 抗兔IgG抗体，所述酶标记可W为辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等。
[0066] 在本发明的试剂盒中，还可W包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗 涂液、显色剂、终止液等。
[0067] 四、用于定量检测人PGI蛋白的英光免疫层析试纸
[0068] 本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人PGI蛋白的英光免疫层析试纸，该 试纸通过双抗体夹也法检测所述人PGI蛋白，其中：
[0069] 所述双抗体夹也法采用标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体作为捕获抗体，所 述第一 PGI单克隆抗体来源于人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的一者；并且
[0070] 所述双抗体夹也法还采用第二PGI单克隆抗体作为检测抗体，所述第二PGI单克 隆抗体来源于人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的另一者；
[0071] 所述人PGI抗原表位肤（1)和（2)分别为：
[0072] (1)Tyr-Lys-Val-Pro-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ;
[0073] (2)Tyr-Lys-Asn-Phe-T虹-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln。
[0074] 在本发明中，在双抗体夹也法英光免疫层析试纸中，"捕获抗体"是指能够首先特 异性识别待测抗原的抗体，其通常包被在结合垫上；"检测抗体"是指另一种能够特异性识 别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别识别待测抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反应膜的检测区上。
[00巧]在本发明中，所述第一 PGI单克隆抗体可W由第一 PGI抗原制备而成，该第一 PGI 抗原可W通过使所述人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成；并 且所述第二PGI单克隆抗体可W由第二PGI抗原制备而成，该第二PGI抗原可W通过使所 述人PGI抗原表位肤（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。
[0076] 在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH (钥孔血蓝蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结合位点多，免疫效果较 好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0077] 优选地，本发明的英光免疫层析试纸中所用的英光微球的粒径为320nm至400nm， 优选为360nm，英光微球上的英光物质可为异硫氯酸英光素、四己基罗丹明、四甲基异硫氯 酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明（可购自上海晶纯公司）。英光微球的微球 材料可W为由聚苯己帰、聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋与其它单体共聚形成的共聚 物，其它单体的例子为苯己帰等。英光微球的激发波长可W为350?600nm，优选为390nm ; 发射波长可W为500?700皿，优选为615皿。
[0078] 在本发明中，英光微球的最大激发波长与发射波长差值较大，说明英光微球有较 大的斯巧克斯（Stokes)位移，该样，英光试纸的背景干扰较低，W该微球做免疫层析标记物 有较强的优势。
[0079] 在一个具体的实施方案中，本发明的英光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板 上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述样 品垫用于在使用时加载待测样品，所述结合垫包被有所述的标记有英光微球的第一 PGI单 克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二PGI单克隆抗体， 所述质控区包被有能与所述的标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体特异性结合的抗抗 体。
[0080] 优选地，本发明的英光免疫层析试纸的样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸可W沿 使用时的层析方向依次搭接设置在底板上(参见图2)。反应膜上间隔设置的检测区和质控 区可W为，但不限于，线、带、块等形式，检测区和质控区优选间隔3mm至8mm。
[0081] 在本发明中，反应膜优选为在大于550nm的波长下基本上不发英光的硝酸纤维素 膜。此外，底板优选基本上不具有英光性质。
[0082] 通常，常规的层析试纸组件(反应膜、底板等)在550nm波长下具有较明显的英光背 景，该对英光信号的检测产生很大干扰。本发明通过采用在大于550nm的波长下基本上不 发英光的硝酸纤维素膜和低英光性质的底板，从而克服了常规英光试纸的缺陷。此外，本发 明所用的英光物质X-罗丹明可产生较强的英光信号，从而进一步大大提高了英光信背比， 使得能够很好地区分信号和背景，进而提高检测灵敏度。
[0083] 在本发明中，样品垫和结合垫的材料可采用本领域通常使用的材料，例如，样品垫 和结合垫可W为玻璃纤维。
[0084] 本发明所采用的能与标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体特异性结合的抗抗 体可W为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单克隆 抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体特异性更高。
[0085] 在一个具体的实施方案中，本发明的英光免疫层析试纸在使用时，在样品垫上滴 加样品液巧日含有PGI的血样)，在毛细管作用下，样品液向吸水滤纸一端移动，在结合垫处 与所述的标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体形成免疫复合物，该免疫复合物进一步移 动，在检测线上与所述第二PGI单克隆抗体结合形成双抗体夹也的免疫复合物，而未形成 免疫复合物的标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体则与质控线上的抗抗体结合。此过程 需要10分钟至15分钟，之后，用英光检测仪进行检测，如果质控线处未出现条带，则说明试 纸失效；如果质控线处出现条带，而检测线处未出现条带，则说明样品中不含人PGI蛋白； 如果在质控线和检测线上均出现条带，则说明样品中含有人PGI蛋白。
[0086] 在另一个方面，本发明提供了一种制备用于定量检测待测物中人PGI蛋白的英光 免疫层析试纸的方法，其包括W下步骤：
[0087] 1)提供标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体；
[0088] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有英光微球的第一 PGI单克 隆抗体；
[0089] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二PGI单克 隆抗体和抗抗体，W分别形成检测区和质控区；和
[0090] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次W接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述英光免疫层析试纸。
[0091] 本领域技术人员可W理解的是，可W根据实际需要对上述步骤的顺序进行调整， 例如步骤3)可W在步骤1)之前，或在步骤1)和2)之间。
[0092] 本发明的方法还可W包括将制成的英光免疫层析试纸切割成适当宽度的步骤5)。
[0093] 本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人PGI蛋白 的英光免疫层析试纸的方法的各个步骤的条件，从而使得本发明的英光免疫层析试纸能够 针对人PGI蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。
[0094] 因此，优选的是，在本发明的方法中，所述步骤1)包括：
[0095] a)用碳二亚胺活化英光微球，优选地，将英光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述英光微球；
[0096] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的英光 微球用N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液洗涂、分散，并经超声波处理；
[0097] C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 PGI单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获 得的英光微球与第一 PGI单克隆抗体混合，用BSA-己醇胺缓冲液封闭，离也，用BSA-吐温 水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体。
[0098] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述步骤1)包括：
[0099] a)用碳二亚胺活化英光微球，其中，取1 (w/v) %的英光微球水分散液，lOOOOrpm至 15000巧m低温(例如1(TC )离也5至10分钟，去上清，将沉淀物分散到500 y 1的蒸觸水或 初洗缓冲液（0. 1M的MES水溶液）中，超声波（240W)处理1至2分钟，重复W上过程H次， 加入碳二亚胺lOmg至50mg，揽拌10?15分钟，从而活化所述英光微球；
[0100] b)洗涂步骤a)所获得的活化的英光微球，其中，将步骤a)所获得的活化的英光 微球在1000巧m至1500化pm下离也5至10分钟，将沉淀物分散到1ml偶联缓冲液（20? lOOmM的N-轻基硫代玻巧醜亚胺-巧樣酸缓冲液）中，超声波（240W)处理1至2分钟，重 复W上过程二次；
[0101] C)用步骤b)所获得的英光微球标记第一 PGI单克隆抗体，其中，按照ly 1至3y 1 抗体（lOmg/ml) /100 y 1所述活化的英光微球的比例，将步骤b)所获得的英光微球与第一 PGI单克隆抗体混合，室温（25°C)下揽拌1. 5?3小时(优选2小时)，加入1ml封闭缓冲液 (1 (w/v) %BSA-〇. 05M己醇胺)，继续揽拌1小时，在10000巧m至15000巧m下离也5至10分 钟，重复离也3次，将沉淀物分散到500 y 1终洗缓冲液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) %吐温水 溶液）中，超声波（240W)处理1至2分钟，用所述终洗缓冲液定容至500 y 1。
[0102] 优选地，在本发明的方法中，所述步骤2)包括；将标记有英光微球的第一 PGI单克 隆抗体用抗体稀释液（l%(w/v)BSA-〇. 01M PBS (pH7. 2)缓冲液)进行稀释，W稀释至0. 5? 2mg/ml，优选为Img/ml，然后用微量移液器均匀喷涂在结合垫上，之后烘干或真空冷冻干 燥。在本发明的方法的步骤2)中，所述的标记有英光微球的第一 PGI单克隆抗体的包被浓 度为0. 5?2mg/ml,优选为Img/ml。
[0103] 优选地，所述步骤3)包括；用喷金机将所述第二PGI单克隆抗体和抗抗体划到硝 酸纤维素膜（固相载体)上W作为检测区和质控区，使检测区和质控区的间隔为3mm至8mm， 所述第二PGI单克隆抗体和所述抗抗体的浓度分别为0. 5?2mg/ml，优选为Img/ml。
[0104] 优选地，结果检测利用专用的英光检测仪(可购自深圳市安群生物工程有限公司， 型号AQ-3000)对质控区和检测区进行检测，检测区与质控区英光强度的比值和待测样品中 的PGI的含量成正比。采用检测区与质控区英光强度的比值而不是直接采用检测区的绝对 英光值可尽可能地减少反应条件、基质等的影响，并尽量避免背景干扰。
[0105] W下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但该些例子不应被理解为 对本发明的保护范围的限制。
[0106] 实施例
[0107] 除非另有说明，W下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。
[0108] 实施例1 ;PGI抗原表位肤（1)和似的制备。
[0109] 制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肤自动合成仪，通过固相法分别 合成PGI抗原表位肤（1)和（2)。抗原表位肤的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肤段 的浓度。本发明的抗原表位肤（1)和（2)的分子量分别为1657. 24U616. 93,利用质谱进行 确定，通过多肤序列测定鉴定所合成的多肤序列。
[0110] 一、PGI抗原表位肤（1)和（2)的合成
[0111] 上述肤段采用固相法合成。固相肤合成的主要思想是：先将所要合成肤链的駿基 末端氨基酸的駿基W共价键形式同一个不溶性的高分子化合物（树脂）相连接，然后W此 结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化駿基组份 反应，接长肤链。该样的步骤可W反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肤链的长 度。该个合成过程如下所示。
[0112]
【权利要求】
1. 一种用于定量检测待测物中人PGI蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹 心法检测所述人PGI蛋白，其中： 所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一 PGI单克隆抗体作为捕获抗体，所述第 一 PGI单克隆抗体来源于人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且 所述双抗体夹心法采用第二PGI单克隆抗体作为检测抗体，所述第二PGI单克隆抗体 来源于人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者； 所述人PGI抗原表位肽（1)和（2)分别为： (1) Tyr-Lys-Val-Pr〇-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ； (2) Tyr-Lys-Asn-Phe-Thr-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln〇
2. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述第一 PGI单克隆抗体是由第一 PGI抗原制备而成的，该第一 PGI抗原是通过使所述人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者 与载体蛋白偶联制备而成的；并且 所述第二PGI单克隆抗体是由第二PGI抗原制备而成的，该第二PGI抗原是通过使所 述人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。
3. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的粒径为320nm至 400nm。
4. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球上的荧光物质为异硫 氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明，其中优选为X-罗丹明；所 述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
5. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的激发波长为350? 600nm，优选为390nm ;发射波长为500?700nm，优选为615nm。
6. 根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述试纸具有底板，并且在该底板 上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结 合垫包被有所述的标记有荧光微球的第一 PGI单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控 区，所述检测区包被有所述第二PGI单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧 光微球的第一 PGI单克隆抗体特异性结合的抗抗体。
7. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述反应膜为在大于550nm的波长 下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜。
8. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述底板基本上不具有荧光性质。
9. 根据权利要求6所述的荧光免疫层析试纸，其中所述抗抗体为羊抗鼠 IgG单克隆抗 体或兔抗鼠 IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠 IgG单克隆抗体。
10. -种制备根据权利要求1至9中任意一项所述的荧光免疫层析试纸的方法，其包括 以下步骤： 1) 提供标记有突光微球的第一 PGI单克隆抗体； 2) 提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一 PGI单克隆抗 体； 3) 提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二PGI单克隆抗 体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；和 4) 在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应 膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤1)包括： a) 用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经 超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球； b) 洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球 用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理； c) 用步骤b)所获得的荧光微球标记第一 PGI单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获得的 荧光微球与第一 PGI单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐温水溶 液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一 PGI单克隆抗体。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中在所述步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第 一 PGI单克隆抗体的包被浓度为0. 5?2mg/ml。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间 隔3mm至8mm，所述第二PGI单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0. 5?2mg/ml。
【文档编号】G01N33/68GK104422773SQ201310370229
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】朱建安 申请人:朱建安