一种岩藻黄醇的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高纯岩藻黄醇的制备方法，属于食品加工技术及功能保健领域。
【背景技术】
[0002]岩藻黄质(fucoxanthin)亦称褐藻黄素，是自可食用褐藻中，如裙带菜(翅藻科，Undaria pinnatifida)，海带(Laminaria japonica Aresch)中提取出来的天然类胡萝卜素，在其刚性全反式长链的两端分别有一个化学性质活泼的5，6-环氧非饱和丙二烯键结构，因而又异于其他类胡萝卜素分子，具有很强的生物活性。近年来它的多种生物学活性已被证实，一些潜在的活性也正在被科学家们积极探求之中，目前己成为当今海洋药物研宄与开发的主攻热点之一。
[0003]岩藻黄醇是岩藻黄质脱去一个乙酰基的代谢产物，其结构与岩藻黄质的结构类似，具有很强的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥等多种生物活性。近年来研宄表明，小鼠口服岩藻黄质后可将其转化为岩藻黄醇而得到利用。Hayato Maeda等研宄也发现3T3-L1细胞系中的岩藻黄质代谢产物岩藻黄醇可以通过减少PPARy (过氧化物酶体增殖激活受体)从而达到抑制3T3-L1前成脂肪细胞系到脂肪细胞系分化的目的，从而达到减肥的效果。有研宄表明，岩藻黄醇的体外抗肿瘤活性甚至强于岩藻黄质。目前国内仅少数几个厂家提取制备低含量岩藻黄质原料(HPLC法，含量< 1% )，出口欧美、日本等国家，目前国内外尚未见到岩藻黄醇批量制备研宄的报道，不能对岩藻黄醇以及岩藻黄醇系列产品进行高值化开发应用，因此，有必要发明一种高纯岩藻黄醇的制备方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种以岩藻黄质为底物，通过酶解反应制备岩藻黄醇得到岩藻黄醇粗提物的方法，还提供一种将岩藻黄醇粗提物再进行分离纯化获得高纯样品的方法。
[0005]本发明一方面涉及一种岩藻黄质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006](I)、以岩藻黄质高纯单体或者以岩藻黄质提取物为原料；
[0007](2)、将原料与脂肪酶、催化剂混合，用PBS缓冲液溶解后在水浴上反应；
[0008]优选地，所述的催化剂为脂肪酶加速剂，优选去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、胆酸钠、甘氨胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠、牛磺胆酸钠盐水合物、甘氨鹅去氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠等胆酸钠盐类物质。
[0009]优选地，所述的脂肪酶为:猪胰腺脂肪酶、牛胰腺脂肪酶、假丝酵母脂肪酶等脂肪酶。
[0010]优选地，步骤2)中所述的将原料与脂肪酶、催化剂混合中，原料:脂肪酶:催化剂的比例为 1:1:1 至 I:40:40,可选自 1:1:1,1:3:2,1:5:5,1:4:2, ,2:5:3,5:4:4，1:2:2，1:3:3,2:10:5，1:10:10，1:20:20，1:40:40 ;
[0011]优选地，步骤2)中所述的PBS缓冲液的pH值为3-11，水浴的温度为20_70°C，反应时间为 0-24h ;pH 值选自 4、5、6、7、8、9、10、11 ;水浴温度选自 20°C、30°C、37°C、40°C、50°C、60°C、70°C ;反应时间选自 0.5h、lh、2h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h。
[0012]优选地，在步骤I)中采用原料为高纯岩藻黄质单体或岩藻黄质提取物，
[0013]纯度为1-99%。
[0014]优选地，所述岩藻黄质的制备方法，还包括3)，将步骤2)获得的反应液进行浓缩至干，用甲醇超声提取，提取液浓缩至干，获得岩藻黄醇粗提物。
[0015]本发明所述的岩藻黄醇的制备方法，可选择的包括步骤4)，将步骤3)获得的粗提物采用柱层析进行初步分离，收集岩藻黄醇馏分，浓缩获得岩藻黄醇粗原料。当步骤I)中所用的原料为岩藻黄质提取物时，优选包括本步骤。
[0016]优选地，步骤4)所述的柱层析为硅胶柱层析或大孔吸附树脂柱层析。
[0017]优选地，步骤4)所述的硅胶柱层析，硅胶粒度为100-400目，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(50:1-5:1)，或者石油醚-丙酮(20:1-3:1)，或者石油醚-乙酸乙酯(20:1_3:I)。优选分别用二氯甲烷-甲醇(50:1,25:1,10:1:5:1)进行洗脱，收集(25:1和10:1)洗脱部分；优选分别用石油醚-丙酮(20:1-3:1)进行洗脱，收集(25:1和10:1)洗脱部分；优选分别用石油醚-乙酸乙酯(20:1-3:1)进行洗脱，收集(25:1和10:1)洗脱部分。
[0018]优选地，步骤4)所述的大孔吸附柱层析，所用的填料为AB_8，D101等其中一种，洗脱剂为乙醇_水(1:99-99: I) ο
[0019]优选地，所述的岩藻黄醇的制备方法，还包括步骤5)，将步骤3)获得的岩藻黄醇粗提物或者步骤4)获得的岩藻黄醇粗原料用流动相溶解，转入半制备/制备型高效液相色谱进样瓶中，启动半制备/制备型高效液相色谱进行分离纯化，通过紫外在线检测信号触发馏分收集器自动收集岩藻黄醇纯化液。
[0020]优选地，步骤5)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的流动相分别为甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液中的一种，甲醇水溶液的体积百分比浓度为70-95%，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60-95%，乙腈水溶液的体积百分比浓度为55-95% ;甲醇水溶液的体积百分比浓度选自:70 %、80 %、90 %、95 % ;乙醇水溶液的体积百分比浓度选自:60%、70%、80%、90%、95% ;乙腈水溶液的体积百分比浓度为55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%。
[0021]优选地，步骤5)所述半制备/制备型高效液相色谱采用的半制备/制备柱填料为C8柱或C18柱。
[0022]优选地，步骤5)所述半制备/制备型高效液相色谱采用的半制备/制备柱的直径为 10_50mm。
[0023]优选地，步骤5)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的进样量为100 μ L/次-20mL/ 次。
[0024]优选地，步骤5)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的流动相流速为5-200mL/min，优选 5、6、10、20、28、50、80、100、120、150、180、200mL/min。
[0025]优选地，步骤5)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长为400-500nm，优选450nm。
[0026]优选地，所述的岩藻黄醇的制备方法，还包括步骤6)，将步骤5)中的岩藻黄醇纯化液进行减压浓缩后，取浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯岩藻黄醇。
[0027]优选地，步骤6)所述减压浓缩温度为20_50°C，干燥方式为冷冻干燥。
[0028]优选地，步骤6)所述高纯岩藻黄醇，纯度大于99%。
【附图说明】
[0029]图1实施例1中岩藻黄醇制备色谱图。
[0030]图2实施例1中岩藻黄醇纯度检测色谱图。
[0031]图3实施例1所制备的岩藻黄醇的核磁共振氢谱图。
[0032]图4实施例1所制备的岩藻黄醇的核磁共振碳谱图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]I)酶解反应:取岩藻黄质(纯度为99% )50mg，加入脂肪酶50mg，牛磺胆酸钠50mg，溶解于pH = 3的0.1M PBS缓冲溶液中，于20°C下反应Ih后，浓缩至干，加入50mL的甲醇超声提取，滤过，滤液浓缩至干，获得岩藻黄醇反应物55mg，岩藻黄醇的转化率为23% ；
[0035]2)岩藻黄醇精制:
[0036]a)原料的配置:将岩藻黄质粗品配置成6mg/mL的溶液；
[0037]b)仪器:半制备型高效液相色谱；
[0038]c)色谱条件:半制备色谱柱为C8柱(250mmX 10mm)，流动相系统为
[0039]70%甲醇水溶液，流动相流速为5mL/min，检测波长为450nm ；
[0040]d)进样体积:100 μ L ;
[0041]通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液100mL，在30°C下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇8mg，纯度99.03%。实施例2
[0042]I)酶解反应:取岩藻黄质(纯度为99% )50mg，加入脂肪酶150mg，牛磺胆酸钠lOOmg，溶解于pH = 7的0.1M PBS缓冲溶液中，于37°C下反应Ih后，浓缩至干，加入50mL的甲醇超声提取，滤过，滤液浓缩至干，获得岩藻黄醇反应物85mg，岩藻黄醇转化率88% ;
[0043]2)岩藻黄醇精制:
[0044]a)原料的配置:将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
[0045]b)仪器:半制备型高效液相色谱；
[0046]c)色谱条件:半制备色谱柱为C8柱(250mmX 10mm)，流动相系统为80%甲醇水溶液，流动相流速为6mL/min，检测波长为450nm ；
[0047]d)进样体积:300 μ L ;
[0048]通过运行制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液150mL，在30°C下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇33mg，纯度99.36%。
[0049]实施例3
[0050]I)酶解反应:取岩藻黄质(纯度为99% )50mg，加入脂肪酶500mg，牛磺胆酸钠500mg，溶解于pH= 11的0.1M PBS缓冲溶液中