专利名称：岩藻糖苷酶诊断试剂盒及岩藻糖苷酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定岩藻糖 苷酶活性的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
1980年法国学者Deugnier等研究发现，原发性肝癌患者血清岩藻糖苷 酶升高，并被众多的研究所证实。故有人提出岩藻糖苷酶可作为原发性肝癌 的肿瘤标志物，与甲胎蛋白联合或参照应用大大提高了诊疗价值。近年来研 究发现，岩藻糖苷酶对某些疾病的发生、发展均具有重要意义。
血清岩藻糖苷酶测定主要有荧光法和比色法。比色法以4-硝基苯a -L-岩 藻吡喃糖苷或4-硝基苯ci-L-岩藻糖苷为底物显色，本法简便，设备要求不 高，国内外广泛采用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶促反应(Enzymatic Catalytic Reaction)技术及偶联技术，连续监测340nm波长处吸光度的变化， 得以测定岩藻糖苷酶活性的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 岩藻糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行岩藻糖苷酶活性测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。
本发明岩藻糖苷酶活性测定方法原理如下
岩藻糖苷岩藻糖苷酶岩藻糖+相应醇类 岩藻糖+辅酶岩藻糖脱氢酶岩藻酮糖+还原型辅酶 这种方法应用岩藻糖苷酶酶促反应连续监测法，岩藻糖苷酶酶解岩藻糖
苷释放岩藻糖，通过岩藻糖脱氢酶的作用，生还原型辅酶，因而在340nm波 长处产生吸收峰。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分 析仪下，检测还原型辅酶在主波长340nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖 苷酶的活性大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂或双剂，如下成分关系的本发明岩藻糖苷酶诊断试剂盒较为理 想
缓冲液 pH8.5 10Ommol/L 稳定剂 20 mmol/L
岩藻糖脱氢酶 200 U/L
岩藻糖苷 5 mmol/L
辅酶(氧化型) 4mmol/L
本发明的岩藻糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷、辅酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷。
岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷、辅酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、岩藻糖苷。 试剂3
缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶。 岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷、辅酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置 可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定岩藻糖苷酶活性的方法，其 氧化型辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的岩藻糖苷酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
岩藻糖脱氢酶 岩藻糖苷 辅酶(氧化型)
50 mmol/L 200 U/L 5 mmol/L 4 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测岩藻糖苷酶样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性 大小。 实施例二
本实施例的岩藻糖苷酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶(氧化型)
4 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
画mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
岩藻糖脱氢酶
200 U/L
岩藻糖苷 5 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测岩藻糖苷酶样品与试
剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时
间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的 活性大小。
实施例三
本实施例的岩藻糖苷酶诊断试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
辅酶(氧化型)
画mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
岩藻糖苷
100mmol/L 50 mmol/L 5 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
岩藻糖脱氢酶 200 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定岩藻糖苷酶活性时，在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应 时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测岩藻糖苷酶样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左 右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性 大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，便于推广应用。
权利要求
1.一种岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)活性测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972210002C1.gif" wi="123" he="26" top= "38" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测Cu+-新铜试剂复合物主波长340nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小测定结果。
2. —种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L 稳定剂 1——50 mmol/L岩藻糖脱氢酶 50——10000 U/L岩藻糖苷 2——30 mmol/L辅酶(氧化型) 0.5——9.0mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶(L-focose dehydrogenase EC l丄l.122、 EC1丄1.116)、岩藻糖苷、辅酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶(L-fUcose dehydrogenase EC 1丄1.122、 EC1丄1.116)、岩藻糖苷、辅酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷组成。
5. 根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶(L-fbcose dehydrogenase EC 1丄1.122、 ECU丄116)、岩藻糖苷、辅酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定 齐ij、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、岩藻糖苷组成；试剂3，由 缓冲液、稳定剂、岩藻糖脱氢酶组成。岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷、辅酶、 在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂l一OOO mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol )、丙二醇(Propylene Glyco)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定岩藻糖苷酶活性的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、岩藻糖脱氢酶、岩藻糖苷、辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促及化学反应，再将反应物置于可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。采用本发明完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号G01N21/25GK101169368SQ20061009722
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司