本发明属于生物工程制品技术领域，具体涉及一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)是A型流感病毒(AIV)所引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。按其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，AIV可分为15个HA亚型和9个NA亚型。其中，禽流感病毒H9N2亚型是Homme等于1970年在火鸡中首次分离得到的，其在禽类中广泛分布，通过抑制宿主的免疫系统、协同其他致病微生物等方式危害禽类养殖，降低生产性能。我国自1998年以来，禽流感H9N2病毒已经大面积存在，造成蛋鸡群产蛋下降和其它鸡群生产性能下降，给养禽业带来巨大的经济损失。同时，禽流感H9N2病毒的广泛、长期存在对禽流感病毒的快速变异、重组等带来了潜在危险，如2013年3月底在上海和安徽两地率先发现了一种新型H7N9亚型禽流感病毒，其就是以禽流感H9N2亚型的6个内部基因与其他亚型禽流感病毒通过基因重排产生的。因此，对禽流感H9N2病毒进行持续的流行病学监测对禽养殖业的健康发展和维护人类的公共健康极其重要。
抗体，是疫病研究、检测和治疗的重要工具。早期人们主要用小鼠、兔子和山羊等动物制备多克隆抗体和单克隆抗体。随着对免疫球蛋白基因结构的解析和各种基因工程技术的涌现，人们开始采用基因工程的手段筛选、制备抗体。噬菌体抗体库技术是其中一种重要的抗体制备方法，其原理是将抗体V区基因与丝状噬菌体衣壳蛋白基因连接，并表达在噬菌体表面，通过目的抗原对抗体库进行多轮亲和吸附、淘筛获得所需的特异性抗体。噬菌体抗体库技术避开了常规单抗制备的细胞融合、亚克隆等繁琐过程，可短期内开发大量抗体，成为新一代抗体制备的重要手段。噬菌体抗体库技术开发的单链抗体ScFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，为完整抗体的1/6，具有多种优点：(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)无Fc段，可与酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断；(3)易于基因操作和基因工程的大量生产，如在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统大量生产。
鉴于禽流感H9N2病毒的巨大危害，通过噬菌体抗体库技术开发抗禽流感H9N2病毒的单链抗体ScFv无疑在该病毒诊断试剂开发、新型药物研究和抗原表位鉴定等方面具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，从而弥补现有技术的不足。通过构建噬菌体展示单链抗体库，“富集-洗脱-富集”的循环操作，从中筛选得到一个抗禽流感H9N2病毒的单链抗体ScFv-IV，并经进一步改造获得单链抗体ScFv-AIV，并构建了表达单链抗体的基因工程菌，从而可以采用生物工程的方法大量的制备该单链抗体。
本发明首先提供一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，所述的单链抗体包含有：
1)氨基酸序列为的SEQ ID NO:1的单链抗体；
2)对1)中序列进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的单链抗体。
编码上述蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
作为优选，单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；
编码上述蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
本发明再一个方面提供一种用于表达上述禽流感H9N2病毒的单链抗体的重组表达质粒，插入有上述的编码基因；
本发明另一个方面提供一种重组宿主菌，携带有上述的重组表达质粒；
本发明还提供一种抗禽流感H9N2病毒单链抗体的制备方法，其制备步骤如下：
1)将抗禽流感H9N2病毒的单链抗体基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒；
2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达抗禽流感H9N2病毒的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出该单链抗体；
3)对重组表达的单链抗体进行纯化后，能用来开发禽流感H9N2病毒的诊断、治疗制剂。
本发明利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达抗禽流感H9N2病毒单链抗体的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了28kD 左右的重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后可用于禽流感H9N2病毒的诊断、预防和治疗。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1抗禽流感H9N2病毒噬菌体单链抗体库的构建
1、将超速离心获得的禽流感H9N2病毒与弗氏完全佐剂1:1乳化后免疫BALB/c小鼠，加强免疫2次至抗体效价达1:100000以上。取小鼠脾脏，液氮研磨，按50-100mg脾脏加入1ml Trizol试剂，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，反复剧烈振荡15s，室温静置2-3min。4℃，12000g/min离心15min，吸取水相于另一干净1.5ml的离心管中，加入0.5ml异丙醇颠倒混匀，于-20℃沉淀30-60min，12000g/min离心10min。保留沉淀，70％的乙醇洗涤1遍，空气中晾干，DEPC处理水溶解沉淀RNA。
2、基因组DNA的去除和反转录合成cDNA(采用天根公司的FastQuant cDNA第一条链合成试剂盒)：
2.1基因组DNA的去除：按下述体系配制基因组DNA去除体系，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。
5×gDNA Buffer 2μl
RNA模板 1μg
RNase-Free ddH2O 补足到10μl
2.2cDNA的合成：按下述体系配制混合液，充分混匀。
将上述基因组DNA的去除体系和反转录体系混合，充分混匀，42℃孵育15min。95℃孵育3min后放于冰上，得到的cDNA可用于后继试验。
3、设计和合成的小鼠抗体轻、重链可变区扩增引物：
扩增单链抗体重链VH的引物：
VH上：
5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3；
VH下：
5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
扩增单链抗体轻链VL的引物：
VL上：
5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3
VL下：
5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
备注：B＝T、C、G；K＝T、G；M＝A、C；R＝A、G；S＝G、C；W＝A、T；Y＝C、T。
用上述引物分别扩增上述cDNA模板，胶回收获得其轻、重链可变区基因片段。
4、将上述扩增到的VH和VL基因片断分别用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离、回收，然后将VH和VL等量混合作为模板进行重叠延伸PCR(SOE-PCR)以装配ScFv片断，条件为94℃1min变性、55℃1min退火、72℃1min延伸，共30个循环。PCR产物即为单链抗体基因片断，VH和VL基因之间是15个氨基酸的linker序列：GGGGSGGGGSGGGGS。
5、将胶回收的ScFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切(Sfi I和Not I)后连接，将连接产物转化到100μl TG1感受态细胞，然后加入900μl 37℃预热的2×YT培养基，37℃振荡培养1h。取上步转化后培养的菌液100μl，用2×YT培养液做梯度倍比稀释，涂布SOB-AG平板，30℃培养过夜。计数平板上的单菌落数，推算抗体库库容量为1×108。剩余的转化后培养的菌液，加入10ml 2×YT(含葡萄糖：2％，Amp：100μg/ml)，37℃培养至对数生长期，加入2×1010噬菌体M13K07，37℃培养1h，4000g/min离心10min，重悬沉淀于200ml 2×YT(含Amp：100μg/ml，卡那霉素：50μg/ml)，37℃振荡培养过夜。4000g/min离心10min后，加入1/5体积量的PEG/NaCl(20％ 的PEG8000，2.5mol/L的NaCl)于4℃沉淀噬菌体30min，9000g/min离心20min，将沉淀噬菌体重悬于2ml含10g/L BSA的PBS中，12000g/min离心5min，上清经0.45μm滤膜过滤，即获得噬菌体单链抗体库。
实施例2单链抗体多样性的分析
随机挑取10个克隆，摇菌扩增后提取质粒，用Sfi I和Not I双酶切，初步鉴定阳性克隆。以S1(S1：5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3)、S6(S6：5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3)为引物进行测序分析，结果10个克隆的测序结果表明序列均与小鼠免疫球蛋白可变区序列一致，符合小鼠轻重链可变区基因结构，排列方式为VH-Linker-VL。其中VH部分为357-367bp左右，VL为320-330bp左右，重链和轻链之间的linker碱基序列全部正确。序列比对表明其同源性达80％以上。
实施例3抗禽流感H9N2病毒单链抗体库的富集
1、将禽流感H9N2病毒液按1∶5(体积比)稀释用碳酸盐包被缓冲液包被到免疫管，2ml/管，4℃过夜。
2、包被完毕，用PBS洗管3次，拍干；用封闭(2％脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37℃封闭2小时。
3、倾去封闭液，用PBS洗管3次，拍干；
4、将上述已获得的初级噬菌体单链抗体库上清，按照MPBS：上清＝2：3的体积比将MPBS和噬菌体上清进行混匀，在室温下进行去干扰化处理20min。
5、将4中处理好液体加入封闭好的免疫管，2ml/管，轻摇温育30min后，再静置温育1.5小时。
6、弃免疫管内噬菌体上清，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干。
7、加入甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱液，2ml/管，37℃作用6min后，迅速加入Tris缓冲液(2mol/L pH 7.4)，200μl/管中和洗脱下来的噬菌体溶液，再加入2ml新鲜的TG1菌液(OD600值约为0.5)，37℃作用1h。完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库。
8、取部分菌液做10倍梯度稀释后，涂布SOBAG板计算输出的噬菌体淘筛量，剩余菌液加入终浓度为100μg/ml Amp和2％葡萄糖，同时加入约4×1010M13 K07噬菌体，静置温育30min后，再250rpm振荡培养30min；1000g 离心10min，去上清，用100ml 2×YT-AK轻悬细胞，37℃，250rpm，培养过夜，开始下一轮淘筛。
9、最终经过3轮淘筛，取获得的菌液，用2×YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOBAG平板，30℃培养过夜；
选出有约100-200个左右菌落的平板，计算菌落数目，乘以稀释倍数，即得相应库容。经过3轮特异性富集淘筛，获得了滴度约为1.0×106pfu/ml的噬菌体重组抗体库。剩余菌液加入无菌甘油至终浓度20％，混匀后，-70℃冻存，标记为三级抗体库。
实施例5单链抗体ScFv-IV的检测及强阳性株的筛选
取72个1.5ml的离心管置培养架上作为培养板，每孔加入2×YT-AG培养基400μl；挑取上述中的SOBAG平板上长出的单个菌落，接种至上面各孔中，此板标记为Master Plate；将Master Plate置于摇床，30℃，250rpm/min，振荡培养过夜；次日，另取72孔培养板，取400μl含有2.5×1010pfu/ml M13K07的2×YT-AG至每孔，此板标为P1Plate；从过夜培养的Master Plate上每孔取40μl培养液至P1Plate；将P1Plate置于摇床，37℃，150rpm/min，振荡培养2小时，1500g离心20min，小心去上清；向P1Plate每孔加入400μl 2×YT-AK培养液，37℃，250rpm/min，振荡培养过夜；1500g离心20min，小心取上清待用。
将超速离心获得的禽流感H9N2病毒液4℃包被酶标板过夜，2％MPBS(含2％脱脂乳的PBS)封闭，洗涤后，以上面获得噬菌体液为一抗，37℃孵育2h，HRP标记的抗M13单抗为二抗，37℃反应1h，洗涤后加入TMB显色液，37℃反应30min，加入2M硫酸终止显色，酶标仪450nm波长下测OD值，设M13K07包被对照孔(阳性对照)和空白包被对照孔，找出阳性克隆(OD值≥0.3且OD值/OD空白孔≥3可以确定为阳性克隆)。ELISA测定各孔上清与禽流感H9N2病毒的结合情况，结果发现12株克隆与抗原有阳性反应，初步确定这12株重组克隆为阳性，其中一株噬菌体抗体为强阳性，命名为IV株。
提取IV株克隆的重组质粒，以S1、S6为引物做PCR鉴定，目的片段用胶回收试剂盒回收后送公司测序，测序结果表明目的ScFv序列排列方式为VH-Linker-VL，序列比对发现符合小鼠轻重链可变区基因结构。在Genebank 中进行Blast同源性比较，发现最大同源性只为93％，表明发生了核苷的变化，是一个新的鼠单链抗体ScFv。为了提高IV株的抗体效价，根据生物软件的蛋白结构预测信息，将IV株的15位赖氨酸(K)变成精氨酸(R)、100位丙氨酸(A)变成精氨酸(R)、192位丝氨酸(S)变成天冬氨酸(D)、228位丝氨酸(S)变成色氨酸(W)、229位丝氨酸(S)变成甘氨酸(G)、230位酪氨酸(Y)变成苏氨酸(T)，并命名为单链抗体ScFv-AIV，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQ ID NO:4，并进行全基因合成，两端分别加上BamHI和Hind III内切酶位点。
实施例6改造后的单链抗体ScFv-AIV与原始单链抗体ScFv-IV的原核表达
1、单链抗体ScFv-IV基因片段的扩增及改造前后重组质粒的鉴定
根据ScFv-IV的基因序列设计一对引物，两端分别加上BamHI和Hind III内切酶：
IV-P1：5-CCAGGATCCATGGCCCAGGTG-3
IV-P2：5-CCG AAGCTTTTACTTCAGCTCCAG-3
在一只0.2mlPCR管内加入下列试剂进行扩增：
纯化PCR产物，与蛋白表达载体pET-30a分别酶切后连接，并转入TOP10菌株接种到含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜，提取重组质粒酶切鉴定。
将全基因合成的改造后的ScFv-AIV基因用BamHI和Hind III内切酶酶切后与蛋白表达载体pET-30a分别酶切后连接，并转入TOP10菌株接种到含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜，提取重组质粒酶切鉴定。
将鉴定好的pET30a-ScFv-IV、pET30a-ScFv-AIV送公司测序，结果正 确无误。
2、单链抗体ScFv-IV、ScFv-AIV的原核表达及纯化
将鉴定好的重组质粒pET30a-ScFv-IV、pET30a-ScFv-AIV分别转入BL21(DE3)大肠杆菌中，在37℃培养至菌液吸光度约0.6时，加IPTG诱导表达目的蛋白，25℃诱导6h，以未加IPTG菌液作对照，进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况。目的蛋白主要以可溶形式表达，采用镍柱纯化，具体步骤如下：
(1)诱导表达后菌液产物经4℃，8000g离心15min，去除上清。
(2)用0.1倍培养基体积的Wash Buffer(20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA)重悬沉淀，充分混匀。
(3)冰上操作，超声裂解细菌。
(4)10000g离心10min，收集超声破碎上清。
(5)镍柱纯化，咪唑洗脱。将收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得单链抗体ScFv-IV、ScFv-AIV。
(6)考马斯亮蓝法分别测定蛋白浓度，用PBS液调整为1mg/ml，-20℃保存。
实施例7间接ELISA法检测单链抗体ScFv-IV、ScFv-AIV的活性
按照最佳包被条件，将禽流感H9N2病毒液4℃包被酶标板过夜；弃包被液，用PBST洗涤2次，拍干酶标板；加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭1.5h；弃封闭液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；分别加上不同稀释度的重组单链抗体ScFv-IV、ScFv-AIV，同时设立PBS液作为阴性对照，37℃反应1h；弃重组抗体液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；将HRP标记抗His的抗体用PBS做1：4000稀释，100μl/孔，37℃孵育反应1h；弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；显色：加入100μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色15min；终止：用100μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。结果见下表。间接ELISA结果表明，单链抗体ScFv-IV与改造后的单链抗体ScFv-AIV均与禽流感H9N2病毒具有较强的结合能力，改造后的单链抗体ScFv-AIV与病毒的结合能力更强(表1)。
表1：间接ELISA检测改造前后重组单链抗体的活性
实施例8阻断ELISA法检测重组单链抗体ScFv-AIV的活性
按照最佳包被条件，将纯化的禽流感H9N2病毒包被96孔板，4℃包被过夜。2％MPBS封闭。将禽流感H9N2病毒液按8倍、4倍、2倍、1倍包被浓度设置4个梯度，每一梯度设立阻断孔和非阻断孔，各为三重复。禽流感H9N2病毒液与单链抗体ScFv-AIV液各50μl在孔外室温反应30min，移至阻断孔，PBS液与重组单链抗体ScFv-AIV液同样反应后移至非阻断孔，37℃反应1h；弃反应液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；将HRP标记抗His的抗体用PBS做1：4000稀释，100μl/孔，37℃孵育反应1h；弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；显色：加入100μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色15min；终止：用100μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。结果显示用来阻断的病毒浓度越高，剩下能够与已包被在ELISA板上得病毒反应的单链抗体量越少，ELISA的OD450值越小，说明重组单链抗体ScFv-AIV与禽流感H9N2病毒结合反应的特异性较好，有阻断作用。
表2：阻断ELISA检测重组单链抗体ScFv-AIV的活性
实施例9双夹心ELISA法检测单链抗体ScFv-AIV的活性
将重组单链抗体ScFv-AIV包被96孔板，4℃包被过夜。2％MPBS封闭，洗涤后加入纯化的禽流感H9N2病毒，各做三个重复，37℃反应1h，洗涤后加入兔抗禽流感H9N2病毒的血清(1：4000稀释)，37℃反应1h，洗涤后加入HRP标记的羊抗兔抗体，37℃反应1h，同上显色及测定OD值。双夹心ELISA结果下表，说明所筛选的重组单链抗体ScFv-AIV能够抑制抗禽流感H9N2病毒的兔多抗与病毒的结合反应。
表3：双夹心ELISA法检测重组单链抗体ScFv-AIV的活性
实施例10重组单链抗体ScFv-AIV的特异性试验
将纯化的禽流感H9N2病毒、鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管病毒(IBV)分别包被96孔板，4℃包被过夜。2％MPBS封闭，洗涤后加入重组单链抗体ScFv-AIV作为一抗，37℃反应1h，洗涤。将HRP标记抗His的抗体用PBS做1：4000稀释，100μl/孔，37℃孵育反应1h；弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，拍干酶标板；显色：加入100μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色15min；终止：用100μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。结果见下表，说明重组单链抗体ScFv-AIV仅能够与禽流感H9N2病毒有反应，而与其他病毒无信号，具有病毒识别特异性。
表4：重组单链抗体ScFv-AIV的特异性
SEQUENCE LISTING
<110> 待确定
<120> 一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Val His Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Phe Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Arg Ser Gly Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser
195 200 205
Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln His Phe Ser Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Leu Lys
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
atggcccagg tgaagttgca gcagagcgga gccgagctgg ttaaacctgg cgcttccgtt 60
aagttgtcct gcaaggcctc cggctatacc ttcaccagct actggattca ctggatcaag 120
cagaggcctg tgcacggcct ggagtggatc ggctacttca accctagcac cggctacacc 180
gcatacaacc agaagttcaa ggacaaggcc accctgaccg ccgacaagag cagcagcacc 240
gcttacatgc agctgagctc cctgactagc gaggacagcg ccgtgtacta ctgcaccgcc 300
aggagcggtg gcgactattt cgactactgg ggccagggca ccacagtgac agtgagcagc 360
ggaggaggcg gaagtggagg tggtggatcc ggcggagggg gtagcgatat agagctcacc 420
cagagccctg ccagcctgag tgtctccccc ggagaaactg tgaccatcac ttgtagggcc 480
agcgagaaca tctacagcaa ccttgcctgg tatcaacaga agcctgggaa gtcaccccaa 540
ttgctggtgt acgccgccac ctcaaatctg gcaagcggcg tgccttccag gttcagcggc 600
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cgttctggtg gtgattactt cgactactgg ggtcaaggta ccactgttac cgtttcttcc 360
ggcggtggtg gctccggtgg cggcggttct ggcggtggtg gtagcgatat tgaactgacc 420
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