检测伏马毒素b1残留的胶体金试纸卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种检测伏马毒素B1残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。本实用新型试纸卡样品吸收垫可以将检测液体充分吸收，与结合物释放垫上喷涂的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差，操作简便快速、结果显示形象直观准确、成本低，灵敏度高。
【专利说明】检测伏马毒素BI残留的胶体金试纸卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测伏马毒素BI的胶体金试纸卡。
【背景技术】
[0002]伏马毒素BI (Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素，目前已知有28种衍生物，分为A、B、C、P四类。其中以FBl最为常见，在自然污染的玉米中，以伏马毒素BI量最多，约占伏马毒素总量的70%。伏马毒素BI与马脑白质软化症、猪的肺水肿症侯群以及人类食道癌等人畜疾病有关。另外，伏马毒素BI还是一种慢性促癌剂，能引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变。
[0003]国内外已建立了多种伏马毒素的检测方法，已经应用的有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管气相色谱法(GC)、毛细管电泳技术(CE)、液质联用(LC/MS)、气质联用(GC/MS)及酶联免疫吸附检测(ELISA)等方法。其中高效液相色谱法(HPLC)，灵敏度高，在全球范围内的玉米及其制品的调查中，90%以上的实验室用的都是HPLC法，其检测限可以达到
0.05?0.lmg/kg。但是，该法需要对检测样品进行严格的预处理，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，同时要求有专业的操作人员，不利于在基层推广使用及大量样本筛选。免疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素BI残留检测。胶体金免疫层析法检测时间短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于进行现场快速筛选。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种灵敏度高、成本低、稳定性好、操作简单、检测时间短、检测伏马毒素BI的试纸卡。
[0005]本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的三分之二区域覆盖于样品吸收垫之下。这样可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收，与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差，还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
[0006]所述反应膜上分别包被有伏马毒素BI半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。
[0007]本实用新型试纸卡的底板为PVC板或其它硬质不吸水的材料；反应膜为硝酸纤维素膜；样品吸收垫由聚酯材料或玻璃棉制成；吸水垫为吸水纸；结合物释放垫由纤维制成，结合物释放垫喷涂有伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金结合物。
[0008]偶联伏马毒素BI半抗原的载体蛋白可用牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白等，在反应膜上的检测线印迹和质控线印迹相互平行且与样品液流动方向垂直，检测线印迹位于靠近结合物释放垫的末端的一侧，质控线印迹位于远离结合物释放垫的末端的一侧。
[0009]本实用新型试纸卡具有如下有益效果:
[0010]1.灵敏度高。伏马毒素BI药物快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸卡具有较高的灵敏度，本试纸卡对样品的检测限为20μ g/kg。
[0011]2.操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品前处理后用滴管滴入试纸卡孔内，滴加2?3滴，加样后计时，7?IOmin内观察结果。
[0012]3.成本低，投资少。使用快速检测试纸卡，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
[0013]4.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线印迹作为试纸卡的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上只有质控线显示红色表示在被检测样品液中伏马毒素BI浓度高于检测限，检测线和质控线均显示红色表示在被检测样品中不含伏马毒素BI或其浓度低于检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现误判。
[0014]5.易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，检测范围广，能较好满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为伏马毒素BI快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；
[0016]图2为伏马毒素BI快速检测试纸卡阴性(图2a)、阳性(图2b)、无效(图2c)显色示意图，其中T为检测线，C为质控线。
【具体实施方式】
[0017]参见图1:样品吸收垫I用聚酯材料制成，结合物释放垫2由纤维制成吸附有伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜3为硝酸纤维素膜，吸水垫4为吸水材料制成，检测线5包被有伏马毒素BI半抗原一载体蛋白偶联物，质控线6包被有羊抗鼠抗抗体，底板7为PVC背衬，在PVC背衬上按顺序粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样品垫，将结合物释放垫三分之二区域覆盖于样品吸收垫下。
[0018]要制成伏马毒素BI快速检测试纸卡首先需制备伏马毒素BI半抗原-载体蛋白偶联物，用于制备检测线；制备胶体金，用于制备金标抗体；制备羊抗鼠抗抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法:
[0019]1.伏马毒素BI半抗原
[0020]36mg伏马毒素和Iml 二甲基亚砜(DMSO)的混合液,室温下缓慢滴加入到14mg对苯二甲醛的Iml DMSO溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2-4小时，除去溶剂，柱层析纯化得到伏马毒素对苯二甲醛单缩合物。
[0021]2.伏马毒素BI半抗原-载体蛋白的偶联
[0022]I)免疫原的制备
[0023]取半抗原13mg溶解于0.8ml 二甲基甲酰胺(DMF)中得到溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA)36mg使之充分溶解在3.2ml0.lmol/L的CB (pH9.6)溶液中得到溶液II，将溶液I逐滴缓慢滴加到溶液II中，并于室温搅拌反应24h，用0.0lmol/L的PBS在4°C下透析三天，每天更换三次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。
[0024]2)包被原的制备
[0025]将BSA换为卵清蛋白(OVA)按上述方法制备得到包被原。
[0026]3.抗伏马毒素BI药物单克隆抗体的制备
[0027]( I)动物免疫
[0028]将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100 μ g/只，使其产生抗血清。
[0029](2)细胞融合和克隆化
[0030]小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0031](3)细胞冻存和复苏
[0032]将伏马毒素BI单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成I X IO6个/ml的细胞悬液,在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0033](4)单克隆抗体的制备与纯化
[0034]将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射伏马毒素BI的单克隆杂交瘤细胞株5X IO6个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20°C保存。
[0035]4.羊抗鼠抗抗体的制备
[0036]以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0037]5.伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0038]5.1胶体金的制备
[0039]用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，取IOOml置于锥形瓶中，置恒温电磁搅拌器上搅拌煮沸，在持续搅拌下每IOOml0.01%氯金酸加入1.25ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈透亮的红色时停止加热，冷却至室温后补足失水，4°C保存。
[0040]5.2伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0041]在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0,按每毫升胶体金溶液加入20?50 μ g抗体的标准向胶体金溶液中加入伏马毒素BI单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA至终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000rpm、4°C离心30min,弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。
[0042]复溶缓冲液:含酪蛋白0.02%?0.1%、吐温-200.05%?0.2% (质量百分含量)、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0043]6.伏马毒素BI快速检测试纸卡检测操作方法
[0044]6.1样本前处理
[0045]称取4.0g±0.05g粉碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3g NaCl,5ml甲醇和5ml去离子水，用涡旋仪涡动3min ;室温(20-25) V 3000g以上离心5min ;移取100 μ I上清液与200 μ I样本复溶液(0.02mol/L的磷酸盐缓冲液)混匀后待检。
[0046]6.2用试纸卡检测
[0047]用吸管吸取稀释后的待检样品溶液滴加入试纸卡加样孔内，滴加2?3滴，加后计时，反应7?IOmin观察结果。
[0048]6.3检测结果分析
[0049]伏马毒素BI在样本中的含量高于或等于试纸卡对其的最低检测限时，伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金标记物与伏马毒素BI结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与伏马毒素BI半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图2所示。
[0050]阴性:当质控线显示一条红色条带，检测线同时也显示出一条红色条带，判为阴性，如图2a所示。
[0051]阳性；当质控线显示一条红色条带，而检测线不显色，判为阳性，如图2b所示。
[0052]无效:当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效，如图2c所示。
【权利要求】
1.一种检测伏马毒素BI残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下；所述反应膜上具有包被有伏马毒素BI半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹，所述的结合物释放垫喷涂有伏马毒素BI单克隆抗体-胶体金结合物。
2.如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于，所述的检测线印迹与质控线印迹平行。
3.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，检测线印迹位于靠近结合物释放垫的末端的一侧，质控线印迹位于远离结合物释放垫的末端的一侧。
4.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为PVC底板或其它硬质不吸水的材料，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫由纤维制成，所述样品吸收垫由玻璃棉或聚酷材料制成，所述吸水塾为吸水纸。
【文档编号】G01N33/577GK203535052SQ201320366577
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2013年6月25日
【发明者】万宇平, 冯才茂, 扶胜, 冯静, 尚朋朋, 彭鸽, 孙震 申请人:北京勤邦生物技术有限公司