专利名称：一种利用dna甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于氨基酸代谢紊乱疾病诊断技术领域，具体涉及一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒。
背景技术：
苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病，涉及位于第12号染色体长臂上的苯丙氨酸羟化酶基因缺陷，导致肝脏内苯丙氨酸羟化酶活性丧失，引起苯丙氨酸代谢障碍。苯丙酮尿症在我国发病率约为1/11800。苯丙酮尿症在遗传上属于单基因遗传病，呈世界性分布，在人群中的发生率随地区、种族而异，如日本1 70000、美国1 12000 1 18000，通过氨基酸分析发现苯丙酮尿症患者血液苯丙氨酸含量高出正常人15倍。氨基酸是构成生命大厦的砖石，人体各种体液中氨基酸组成的变化能够直接反映机体的健康水平和营养状况，并与多种病理过程有关。本发明的发明人临床氨基酸分析25例PKU患者血清及85例正常人血清，发现PKU 患者血清精氨酸含量为(0.014士0.008)，正常人血清精氨酸含量为(0. 129 士0.014)数据显示两者差异明显(P<0. 001)，提示PKU患者精氨酸合成障碍。肝脏是鸟氨酸循环的重要器官，鸟氨酸循环又称“尿素循环”。是机体对氨的一种解毒方式。它的重要生物学意义是将体内蛋白质代谢产生的较高毒性的氨转化为低毒的尿素，从而排出体外。肝脏是哺乳类动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)的作用使精氨酸水解为鸟氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶是鸟氨酸循环的关键酶之一。通过进一步的研究发现 PKU患者精氨酸代琥珀酸合成酶基因的启动子区域CpG岛呈甲基化状态，这也可能解释为精氨酸合成障碍的原因。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。表遗传学研究基因表达的变化，这种变化可通过减数分裂遗传，但不涉及有关基因DNA序列的改变。表观遗传是一种没有DNA序列变化并且可以遗传的基因功能变化。甲基化是表遗传修饰的一种重要形式，是基因型和表型间的重要纽带。DNA甲基化受到DNA甲基化转移酶的调控，并在细胞增殖分化的过程中，将基因的甲基化状态遗传给后代。真核生物DNA甲基化的差异，在基因表达的调节过程中以多种形式起着重要作用。随着DNA甲基化研究方法的不断发展和进步， 人类正加快探索DNA甲基化的奥秘。DNA甲基化在遗传等疾病的研究中取得进展。甲基化已成为生物学研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒。本发明的目的还在于提供一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的标志物。本发明的目的还在于提供利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒的使用方法。
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一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒，包括dNTP、IOxPCR buffer、MgCl2、ddH20、Taq DNA 聚合酶、标准血液 DNA、引物 MSP-R、引物 MSP-L、引物 UMSP-R、 弓I物UMSP-L、弓I物BSP-Rl、引物BSP-Ll、弓|物BSP-R2、引物BSP-L2 ；所述弓|物MSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo. 1所示，引物MSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示，引物UMSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，引物UMSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示，引物BSP-Rl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示，引物BSP-Ll的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示，引物BSP-L2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示，引物BSP-R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为引物MSP-R、MSP-L 配对，引物 UMSP-R、UMSP-L 配对，引物 BSP-Rl、BSP-Ll 配对，引物BSP-R2、BSP-L2配对，用于检测ASS基因(GeneBankNGJ) 11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)启动子区甲基化情况。所述标准血液DNA为取自无苯丙酮尿症健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的标志物，所述标志物为ASS基因 (GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化的启动子区域，该区域包括一个或多个甲基化的CpG岛；所述ASSteeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因) 基因甲基化的启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒的使用方法，包括如下步骤(1)从血液样品中提取基因组DNA ；(2)将基因组DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶；(3)利用权利要求1所述试剂盒及引物配对方案，以ddH20、标准血液DNA、经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板，进行甲基化特异性PCR反应；(4)用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如果以ddH20、标准血液DNA为模板的 PCR无扩增条带，而以经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板的PCR扩增有扩增条带，且扩增条带与预测的条带大小一致，则认为所检测的血液样品来自苯丙酮尿症患者。本发明的有益效果采用本发明的试剂盒，通过检测ASS基因启动子区的甲基化情况判断基因的表达情况，配合体内精氨酸含量的测量，进而能够提前预测苯丙酮尿症的患病概率，及时采取预防措施，减轻苯丙酮尿症患者的痛苦。
图1为苯丙酮尿症患者和正常人血清中精氨酸的含量。图2为Ass基因启动子区DNA甲基化PCR扩增(MSP)；图中，1为ddH20对照、2-3为正常人血清DNA、4_7为苯丙酮尿症患者血清DNA。图3为Ass基因启动子区DNA甲基化PCR扩增(BSP)。图4为Ass基因CpG岛区域在正常人和苯丙酮尿症患者的BSP测序结果；图中，白点为CpG非甲基化位点，黑点为CpG甲基化位点，苯丙酮尿症患者甲基化位点在+45 ；-118。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂盒的说明书。以下实施例使用的Taq DNA聚合酶购自invitrogen公司，大肠杆菌菌株T0P10购自北京TIANGEN公司，DNA提取kit购自Qiagen公司，DNA甲基化kit购自ZYMO RESEARCH 公司。实施例1生物样本选择及其氨基酸分析选择山西省妇幼保健院提供的17例苯丙酮尿症患者为实验对象。年龄8个月 10岁，根据新生儿疾病筛查方法，婴儿出生72h取足跟部血，发现血液苯丙氨酸浓度> 120ymol/L(2mg/dL)时，诊断为高苯丙氨酸血症，均无并发症和其他基础疾病。由院方告之家长同意后取血。体质量均正常。835型全自动氨基酸分析仪(日立公司)，氨基酸标准品(Sigma公司)。取苯丙酮尿症患者空腹静脉血lmL，3000r/min 15min,取血清0. 5mL与 5%的磺基水扬酸1 1混勻，充分振摇，离心机lOOOOr/min，IOmin,取上清液，直接进行氨基酸含量分析。分析17例苯丙酮尿症患者血清和38例正常人血清，数据采用SPSS 10. 0软件作统计学处理，Excel作图，采用t检验，结果见图1，苯丙酮尿症患者血清中的精氨酸含量显著低于正常人血清的含量。实施例2引物设计(1)根据ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)序列，筛选甲基化靶序列区域，其碱基序列如SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。(2)根据SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的甲基化靶序列和特异性甲基化位点，使用“MethPrimer ”软件，设计甲基化PCR的特异性引物序列如下MSP-R :5，-TAGGAGGTAAGTTTTTCGAAGGAC-3，(SEQ ID No. 1)；MSP-L :5，-GATTCCTAACCCTAACCCGC-3，(SEQ ID No. 2)；UMSP-R :5，-GTTAGGAGGTAAGTTTTTTGAAGGAT-3，(SEQ ID No. 3)；UMSP-L :5，-CAATTCCTAACCCTAACCCA-3，(SEQ ID No. 4)；BSP-Rl :5，-TATTAGAGGTTATGGTTGGGGAG-3，(SEQ ID No. 5)；BSP-Ll :5，-CCCAAATCTCCATATAAAAACTTCA-3‘ (SEQ ID No. 6)；BSP-R2 5' -GGTTTTGGGGGTTGTAGAAGGTT-3，(SEQ ID No. 7)；BSP-L2 5' -AAAACCCCTTCCCTCCTACCTC-3，(SEQ ID No. 8)。实施例3血液样品中DNA的提取和甲基化修饰抽取正常人和苯丙酮尿症患者足跟部血液各200 μ L，按照Qiagen kit试剂盒说明书进行DNA提取，紫外分光光度计测定A260，计算含量。将提取的DNA按照DNA甲基化kit试剂盒说明书进行DNA的甲基化修饰(重亚硫酸盐处理)，经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。实施例4甲基化特异性PCR
以无苯丙酮尿症人血液提取并经重亚硫酸盐处理的DNA和ddH20为对照模板，苯丙酮尿症患者血液提取并经重亚硫酸盐处理的DNA为模板，采用下述方案做甲基化特异性 PCR 引物MSP-R、MSP-L配对，引物UMSP-R、UMSP-L配对检测ASS基因启动子区的甲基
化情况，反应体系如下
10 X PCR buffer2μ1 IOmMdNTP0.5μ1 上游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1 下游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1
模板 DNA2μ1 TaqDNA 聚合酶0.25μ1 _ddH20_14.25μ1
Total20μ1PCR 反应过程为:94°C，3min ；然后 94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，60s，反应 32 个循环；72°C延伸 IOmin0扩增产物经1. 0% (质量分数)琼脂糖凝胶(0. 5mg/L溴化乙锭)电泳(如图2所示)，引物MSP-R、MSP-L扩增产物长度为116bp(SEQ ID No. 9)，UMSP-R、UMSP_L扩增产物长度为 119bp(SEQ ID No. 10)。引物BSP-Rl、BSP-Ll配对，引物BSP-R2、BSP-L2配对进行巢式PCR检测ASS基因启动子区的甲基化情况，反应分两轮进行第一轮PCR，引物为BSP-Rl、BSP-Ll，反应体系如下
10 X PCR buffer2μ1IOmMdNTP0.5μ1 上游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1 下游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1
模板DNA2μ1TaqDNA 聚合酶0.25μ1 _ddH2Q_14.25μ1
Total20μ1PCR 反应过程为95°C，3min ；然后 94°C，30s ；62°C, 30s ；72°C，60s，反应 32 个循环；72°C 延伸 5min。扩增产物经1. 0% (质量分数)琼脂糖凝胶(0. 5mg/L溴化乙锭)电泳(如图3所示)，扩增产物长度为950bp (SEQ ID No. 11)。第二轮PCR，引物为BSP-R2、BSP-L2，模板为第一轮扩增产物稀释100倍，取Iul反应体系如下
PCR 反应过程为95°C，3min ；然后 94°C，30s ；62°C, 30s ；72°C，60s，反应 32 个循环；72°C 延伸 5min。扩增产物经1. 0% (质量分数)琼脂糖凝胶(0. 5mg/L溴化乙锭)电泳，扩增产物长度为 721bp(SEQ ID No. 12)。实施例4PCR产物TA克隆、细菌转化与克隆测序按照Trans GenPpEASY2TVector试剂盒说明进行载体连接和细菌转化，蓝白斑筛选阳性克隆并以白斑菌液为模板，利用通用引物进行PCR扩增，筛选插入目的片段的阳性 克隆。PCR反应体系2. 0μ 1 IOX缓冲液、0.5μ1 dNTP、上下游引物10 μ mol/1各 0· 5μ 1、0· 25μ 1 DNA Taq 酶、14. 25 μ 1 ddH20 和 2 μ 1 模板。PCR 反应条件94°C预变性 3min，94°C 30s，55°C 30s, 72°C 60s, 32 个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物经1.0% (质量分数)琼脂糖凝胶(0. 5mg/L溴化乙锭)电泳。将阳性克隆菌液100 μ 1送TIANGEN生化科技(北京)有限公司测序。测序结果如图4所示，白点为CpG非甲基化位点，黑点为CpG甲基化位点，苯丙酮尿症患者甲基化位点在+45 ；-118。
权利要求
1.一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒，包括dNTP、IOxPCR buffer、 MgCl2, ddH20、Taq DNA聚合酶，其特征在于，还包括标准血液DNA、引物MSP-R、引物MSP-L、 弓I物UMSP-R、弓I物UMSP-L、弓|物BSP-Rl、引物BSP-Ll、引物BSP-R2、引物BSP-L2 ；所述引物 MSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，引物MSP-L的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2所示，引物UMSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，引物UMSP-L 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示，引物BSP-Rl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示，引物BSP-Ll的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示，引物BSP-L2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示，引物BSP-R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为引物MSP-R、MSP-L配对，引物UMSP-R、UMSP-L配对，引物BSP-Rl、BSP-Ll配对，引物 BSP-R2、BSP-L2配对，用于检测ASS基因(GeneBankNGJ)11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)启动子区甲基化情况。
2.根据权利要求1所述一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒，其特征在于，所述标准血液DNA为取自无苯丙酮尿症健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。
3.一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的标志物，其特征在于，所述标志物为 ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化的启动子区域，该区域包括一个或多个甲基化的CpG岛；所述ASS (GeneBankNGJ)11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11 所示。
4.权利要求1所述利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤(1)从血液样品中提取基因组DNA;(2)将基因组DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶；(3)利用权利要求1所述试剂盒及引物配对方案，以ddH20、标准血液DNA、经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板，进行甲基化特异性PCR反应；(4)用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如果以ddH20、标准血液DNA为模板的PCR 无扩增条带，而以经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板的PCR扩增有扩增条带， 且扩增条带与预测的条带大小一致，则认为所检测的血液样品来自苯丙酮尿症患者。
全文摘要
本发明属于氨基酸代谢紊乱疾病诊断技术领域，具体涉及一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒。采用本发明的试剂盒，通过检测ASS基因启动子区的甲基化情况判断基因的表达情况，配合体内精氨酸含量的测量，能够提前预测苯丙酮尿症的患病概率，及时采取预防措施，减轻苯丙酮尿症患者的痛苦。
文档编号C12Q1/68GK102424856SQ20111044986
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年9月9日
发明者周柔丽, 李莉, 杨华, 林明, 肖军军, 邵根泽 申请人:北京大学