专利名称：携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白ns3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于融合蛋白及其重组表达方法与应用，特别是涉及一种携带牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与其在牛病毒性腹泻病毒的ELISA检测中的应用。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)属于黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，为单股正链RNA病毒，与羊边界病病毒(Border diseasevirus, BDV)以及猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)在血清学上有交叉反应(殷震，刘景华.动物病毒学[M].第2版.科学出版社，1997. 631-645)。BVDV感染往往是亚临床性的或导致轻微和非特异性临床症状。然而，经胎盘感染可产出免疫耐受的持续性感染牛犊，这些持续感染动物终生带毒，持续排毒，成为牛群中的重要传染源，加重牛群的感染(ffeiland E. Ahl R.Stark et al. A second envelope lycoproteinmediate neutralization of a pestivirus hog cholera virus [J]Virol,1992, (66) 3677-3682)。BVDV的感染分布全球，虽然感染率不同，但感染往往在许多国家流行，持续性感染的牛(PI)最高可达到1-2%，抗体阳性的牛可达60-85% (Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus(BVDV) infections. Vet Microbiol, 1999,64 (2-3) :89-107)。长期以来，该病一直严重影响畜牧业的发展，同时BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精、冷冻胚胎及疫苗等)的常在污染源，给畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。BVDV 检测的“金标准”为病毒中和试验(Edwards S. The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle. Rev Sci Tech,1990,9 (1) :115-30),此方法敏感且特异，但需要进行细胞培养且劳动量大。而ELISA方法检测BVDV操作简便， 费用低，可用于大批量样本的检疫，非常适用于临床诊断和检疫。传统的ELISA试剂盒基于BVDV感染的细胞，但BVDV在组织中产生的蛋白量较低，很难获得充足数量的纯蛋白质用于 BVDV 的诊断(Justewicz DM, Magar R, Marsolais G, et al. Bovine viral diarrhea virus-infected MDBK monolayer as antigen in enzyme—linked immunosorbent assay (ELISA) for the measurement of antibodies in bovine sera. Vet. Immunol. Immunopathol,1987，14(4) :377-384)。在病毒蛋白中，结构蛋白EO和E2，非结构蛋白NS3已被确定为BVDV的主要免疫原(Bolin SR. Immunogens of bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol, 1993, 37(3-4) :263-271)。非结构蛋白NS3在瘟病毒属内保守，行使相似的功能，在病毒增殖过程中，NS3蛋白出现在内质网中，直接参与病毒蛋白的加工过程。该蛋白具有蛋白酶活性 (Protease)和解旋酶活性(Helicase)。NS3蛋白是一种免疫优势蛋白，在自然感染或弱毒活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对NS3蛋白的抗体(Brown LM, Papa RA, Frost MJ， et al. A single amino acid is critical for the expression of B—cell epitopes on the helicase domain of the pestivirus NS3protein. Virus Res，2002，84(1-2) 111-1 )，具有重要的诊断价值。同时，由于NS3蛋白本身的非结构性质，动物在接种传统灭活疫苗后，NS3抗体的检测可以区分疫苗接种或自然感染的动物。很多研究人员建议由 NS3作为诊断检测试剂，便于疫苗接种或NS3血清学监控天然感染(Sandvik T. Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle.Vet Microbiol,1999,64(2-3) :123-34 ；Reddy JR, Kwang J, Okwumabua 0， et al.Application of recombinant bovine viral diarrhea virus proteins in the diagnosis of bovine viral diarrhea infection in cattle.Vet Microbiol,1997, 57(2-3) :119-33 ；Deregt D, Masri SA, Cho HJ, et al. Monoclonal antibodies to the p80/125gp53proteins of bovine viral diarrhea virus their potential use as diagnostic reagents. Can J Vet Res, 1990,54(3) :343-348)。近十多年来，国外已有表达NS3蛋白或其截短片段作为诊断抗原，建立ELISA诊断方法用于检测牛群中BVDV抗体的报道。而且hth等在2006年通过多种重组ELISA方法的比较确定了 NS3抗原可以检测到由病毒中和实验和其它结构蛋白ELISA方法判定为阴性的样品中的抗BVDV抗体 (Chimeno Zoth S,Taboga 0. Multiple recombinant ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus antibodies in cattle sera. J Virol Methods,2006,138 (1-2) 99-108)。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组诊断抗原，涉及一种携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白。本发明所提供的携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，是在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的氨基(N)端连接有折叠酶DsbA 的融合蛋白。其中，所述DsbA自氨基端(N端)位与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸(Cys) 突变成丝氨酸(Ser)，目的是使目的基因与突变后的DsbA融合，实现胞内可溶性有活性的高表达(表达量大于30% )。具体来讲，所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，命名为DsbA/BVDV NS3，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的 SEQ ID No 1 ；2)将序列表中SEQ ID No 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有丝氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性的蛋白质。序列表中的SEQ IDNo :1由563个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1_215位为折叠酶DsbA的氨基酸残基序列，自氨基端第218-561位为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的氨基酸残基序列。编码上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白的基因 (DsbA/BVDVNS3)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID No 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有丝氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0. IXSSPE(或0. 1 X SSC) ,0. 1 % SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID No 2由1689个碱基组成，其编码序列为自5，端第1-1689位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第1-645 位碱基编码折叠酶DsbA，自5’端第652-1683位碱基编码牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供一种上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白 NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法。本发明所提供的上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法，是将含有上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主中，经表达、纯化得到携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白。在上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法中，所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因可采用转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到，用于扩增该基因的上、下游引物序列分别如序列表中SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。序列表中SEQ ID No :1由33个碱基组成，SEQ ID No 2由31个碱基组成，其中 SEQ ID No 1自5’端的第1位至第6位碱基为BagII酶切位点，SEQ ID No 2自5’端第1 位至第6位碱基为NheI酶切位点。用于构建含有上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体的出发载体可为任意一种携带折叠酶DsbA基因的原核表达载体 pET-DsbA。其中，以pET-DsbA为出发载体构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体为pET-DsbA-NS3。所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因位于原核表达载体pET-DsbA多克隆位点处的BagII和Nhe I限制性酶切位点之间。所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为BL21 (Rosetta)、BL21 (DE3)、BL21 (DE3, plysS)，E. coli JM109, E. coli HBlOl 或 E. coli ToplO 等，优选为 BL21 (Rosetta)。其中，以大肠杆菌BL21 (Rosetta)为出发菌株构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体pET-DsbA-NS3的工程菌为 BL21 (Rosetta) /DsbA_NS3。上述重组表达载体和工程菌均可按照常规方法构建。培养含有本发明携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。所述宿主为大肠杆菌时，需加入终浓度为0. 1-0.3% (优选为0.2%)的葡萄糖和 0. 8mM-l. 2mM(优选为ImM) IPTG诱导表达，诱导温度为30°C，诱导时间为1_5小时。所述对诱导表达的目的蛋白进行纯化的方法优选为镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化。本发明提供了一种携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白及其编码基因。本发明的融合蛋白是将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的氨基(N)端连接折叠酶DsbA后得到的融合蛋白。所述DsbA去掉了信号肽，同时将 DsbA与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸(Cys)突变成丝氨酸(Ser)，经过突变后的DsbA 与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合可实现NS3基因的胞内可溶性有活性的高表达(表达量大于30%)。本发明融合蛋白的表达方法中采用携带T7启动子和 DsbA基因的pET-DsbA表达载体，同时选用凝血酶切割位点作为牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白NS3优势区基因的插入位点，且由于该基因的编码蛋白是非糖基化蛋白，因而表达的牛病毒性腹泻病毒NS3免疫优势蛋白具有很好的抗原性，可用于牛病毒性腹泻病毒的ELISA检测，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫优势区基因的RT-PCR扩增结果图2为克隆载体pMD18-T-NS3的PCR鉴定结果图3为重组表达载体pET-DsbA_NS3的PCR鉴定结果
图4重组表达载体pET-DsbA_NS3的测序结果图5为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白表达产物的12% SDS-PAGE电泳检测结果图6为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白表达上清经纯化浓缩后的12% SDS-PAGE电泳检测结果图7为间接ELISA测定牛病毒性腹泻病毒抗体的结果
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白及其重组表达一、携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的扩增1、引物设计
根据牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的mRNA序列，设计用于扩增牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区基因的上、下游引物Pl和P2，其中在上游引物Pl中加入BagII 酶切位点，下游引物P2中加入NheI酶切位点，具体的引物序列为Pl AGATCTATGGTCAAGA AGATAACCAGCATGAAC(带下划线的碱基序列为BagII酶切位点)(序列表中SEQ ID No 3)， P2 :GCTAGCCTCCCTAAAGGATTTCGTCACGTTG (带下划线的碱基序列为NheI酶切位点)(序列表中 SEQ ID No 4)。2、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3免疫优势区基因的扩增用反转录聚合酶反应(RT-PCR)的方法扩增牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3免疫优势区基因，具体方法包括以下步骤1)将MDBK细胞(牛肾细胞)培养的病毒悬液反复冻融3次，4°C、8000i 离心 20min,取上清，分别加入终浓度为10 %和3 %的PEG20000和NaCl，4°C磁力搅拌过夜。次日， 4°C、8000r离心30min，弃上清，沉淀用PBS重悬。分别配置30 %、；35%、40%、45 %的CsCl 溶液，制备CsCl浓度梯度，加入病毒浓缩液后，4°C、22000r/min离心16h，对浓缩的病毒液
进行纯化。2)取病毒浓缩液10 μ 1加入200 μ 1 PBS，加入400μ 1 Trizol，轻混lmin，室温静止IOmin,再加入400 μ 1氯仿，轻混lmin,室温静止IOmin,于4°C、12000g离心15min,吸取上层液，加入一倍体积以上的异丙醇，_30°C沉淀30min，于4°C、14000g离心lOmin，用灭菌 9μ 1 DEPC水重悬沉淀。3)用反转录聚合酶反应(RT-PCR)得到牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3免疫优势区基因的cDNA，反应体系为5 X RT-PCR buffer 4 μ 1，下游引物P22 μ 1，鼠源反转录酶1μ 1，DEPC水4μ 1，42°C反转录lh，再以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为cDNA 3μ 1,2XPCR buffer 12. 5 μ 1，上游引物 Pl 1“1，下游引物卩2 1μ 1, ddH20 8·5μ1，反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共32个循环；最后 72°C延伸10min，4°C终止反应。4)将步骤3)经PCR扩增获得的DNA片段用北京天根公司的DNA片段纯化试剂盒进行纯化，具体步骤为将DNA扩增片段进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，分离结果如图1 所示(M :DL2000Marker ；a 阴性对照；b :DsbA/BVDV NS3 基因的 RT-PCR 产物)，经 PCR 扩增获得了约1032bp的目的片段，与预期结果相符，EB染色以后，于长波紫外灯下切取含有该目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌1.5mL EP管中，加入400μ 1溶胶液，于50°C水浴5min， 期间轻弹EP管，凝胶完全溶化，然后将溶化的液体转至一回收柱，于室温静置5min，SOOOr/ min离心lmin，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗涤两次，最后12000r/min离心lmin，回收柱转至一干净无菌1. 5mL EP管中，加10 μ 1洗脱液洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心lmin，收集管中即为回收的DNA片段。洗脱后的DNA贮存于4°C或_20°C。二、携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达1、克隆载体pMD18-T-NS3的构建将步骤一纯化的目的基因与克隆载体pMD18_T(购自大连宝生物工程有限公司)连接，20μ 1连接体系包括0.5μ 1 PMD18-T载体、4. 5μ 1目的基因纯化产物和 5μ 1 Solution I，16°C过夜。反应结束后，将连接产物转化至Ε. coli T0P10F感受态细胞中，提取质粒DNA进行PCR鉴定，结果如图2所示(M :DL2000Marker ；a:阴性对照；b PMD18-T-NS3PCR鉴定结果)，表明获得了携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区基因的阳性克隆，将该携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区基因的重组克隆质粒命名为 pMD 18-T-NS3。2、重组表达质粒pET-DsbA_NS3的构建与转化BL21 (Rosetta)感受态菌将pMD18-T-NS3质粒进行BagII、NheI双酶切，表达载体pET-DsbA(购自晶美生物公司)进行BamHI、NheI双酶切，再将两个载体的双酶切产物用T4DNA连接酶16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌感受态菌BL21 (Rosetta)，提取质粒DNA，以PI、P2为引物进行PCR扩增，结果如图3所示(M :DL2000Marker ；a :pET-DsbA_NS3PCR鉴定结果；b 阴性对照)，经扩增获得了 1032bp的DNA片段，与预期结果相符，再挑选阳性克隆，进行测序鉴定，测序结果如图4所示，结果编码携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白的基因(命名为DsbA/BVDV NS3)具有序列表中SEQ ID No :2的DNA序列，序列表中的SEQ ID No 2由1689个碱基组成，其编码序列为自5，端第1-1689位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第1-645位碱基编码折叠酶DsbA，自5，端第652-1683位碱基编码牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3 优势区。上述测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的含有携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白基因的重组表达载体，命名为pET-DsbA-NS3，将携带有 pET-DsbA-NS3的重组大肠杆菌工程菌命名为BL21 (Rosetta)/DsbA_NS3。3、携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白的诱导表达挑取单个克隆的重组大肠杆菌工程菌BL21 (Rosetta) /DsbA_NS3，接种于3mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基，37°C振摇培养过夜，次日按的比例扩大培养，37°C 振摇培养池后(吸光光度为0. 6-0. 8)，加入IPTG (终浓度为l.Ommol/L)、葡萄糖(终浓度为0. 2% )，继续于30°C振摇培养诱导4h-6h，收集菌体。4、SDS-PAGE蛋白电泳检测用12 % SDS-PAGE凝胶分离步骤3重组表达的蛋白，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，结果如图5所示(a,b,c,d,e分别为pET_DsbA-NS3诱导5h，4h，3h，2h，Ih产物； f为空载体诱导汕；M为蛋白质相对分子量标准250kDa，150kDa，100kDa，80kDa，60kDa， 50kDa，40kDa，30kDa，25kDa，20kDa，15kDa, IOkDa)，经表达获得了 62. 9kDa 的重组蛋白，与
预期结果相符，表明牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白已获得表达。5、表达产物的分离纯化取诱导菌液200mL收集菌体，用50mmol/L pH7. 4的PBS缓冲液约5mL悬浮菌体， 超声法破碎菌体，超声条件为功率200W，超声3s、停2s为一个循环，共180个循环超声破碎，超声液离心12000r/min 15min，取上清，用针对His标签的镍琼脂糖凝胶柱纯化，具体操作为将样品加入经缓冲液(0. 5mol/L NaH2P0419mL,0. 5mol/LNa2HP0481mL, NaCl 29. 3g， pH7. 4)洗涤的亲和层析柱，用含lOOmmol/L咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，纯化后的蛋白装入透析袋，于透析液(PH7.4PBQ中，4°C透析20h。对纯化蛋白进行12 % SDS-PAGE凝胶分；离蛋白质，结果如图6所示(a为pET-DsbA-NS3诱导产物纯化后；b为pET-DsbA_NS3诱导产物纯化前；M为蛋白质相对分子量标准:250kDa, 150kDa, IOOkDa, 80kDa, 60kDa, 50kDa, 40kDa, 30kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa，IOkDa)，表明牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫优势区融合蛋白已得到纯化。实施例2、间接ELISA法检测牛病毒性腹泻病毒抗体1、间接ELISA最佳反应条件的选择BVDV抗原最佳包被浓度与阴阳血清最佳稀释度的选择(采用方阵试验进行工作浓度的筛选)取纯化的实施例1得到的重组NS3融合蛋白，用包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，PH9. 6)稀释为8 μ g/mL、4 μ g/mL、2 μ g/mL、1 μ g/mL,加入酶标板，100 μ L/孔，每个浓度作一行，4°C过夜，取出用 PBST (NaCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g, Na2HP04 1. 15g，KCl 0. 2g，Tween-20 0. 5mL，加去离子水至 lOOOmL，调 pH 至 7. 4)洗涤 3 次；然后每孔加入250 μ L封闭液(PBST+1 %明胶)，37°C封闭2h，PBST洗涤3次；用PBST将牛阳性血清和阴性血清(标准阳性血清和标准阴性血清)分别作1 20、1 40,1 80,1 160、
1 320稀释，加入酶标板中，每个稀释度作一列，以PBST为空白对照，IOOyL/孔于37°C反应lh，洗涤3次；加入1 1000兔抗牛IgG-HRP(北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司UOOyL/孔，37 °C反应lh，经洗涤后加入TMB底物100 μ L，室温避光作用10-15min，加入50 μ L 2mol/L H2SO4终止反应，测定0D45(lnm。以阳性血清孔的OD值接近1. 0，P/N彡2. 1 的抗原、血清最大稀释度作为抗原及待测血清的最适工作浓度。实验确定包被抗原浓度为
2μ g/mL)，血清抗体最佳稀释度为1 40。2、间接ELISA法测定牛病毒性腹泻病毒血清抗体以方阵滴定所确定的抗原包被浓度Qy g/mL)作为包被抗原工作浓度，对收集的 6份牛血清样品(经牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒(INGEZIM公司产品)检测为阳性) 进行抗体检测，同时设空白对照孔(PBST)和阴性对照孔(标准阴性血清)。具体操作取纯化的实施例1得到的重组NS3融合蛋白，以2 μ g/mL包被酶标板， 将1 40稀释的牛血清样品和阴性对照血清加入酶标板中，100μ L/孔，于37°C反应lh，洗涤后加入1 1000兔抗牛IgG-HRP (北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司)，100 μ L/ 孔，37°C反应lh，洗涤后加入TMB底物100 μ L，室温避光作用10_15min，加入50 μ L2mol/L H2SO4终止反应，测定结果如图7所示(1-6为6份血清)，表明重组NS3蛋白能与牛抗血清产生阳性反应，克用于检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体中。
权利要求
1.携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，是在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的氨基(N)端连接有折叠酶DsbA的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述DsbA自氨基端与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸(Cys)突变成丝氨酸(kr)。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQID No 1 ；2)将序列表中SEQID No=I的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有丝氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性的蛋白质。
4.编码权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，编码权利要求3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 2的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 1的DNA序列；3)与序列表中SEQID No :2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQID No 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
6.含有权利要求4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
7.—种重组表达权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白 NS3优势区的融合蛋白的方法，是将含有权利要求4或5或6所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主中，经表达、 纯化得到携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白；所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因采用转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到，用于扩增该基因的上、下游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。
8.根据权利要求7所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法，其特征在于，用于构建含有上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体的出发载体为任意一种携带折叠酶DsbA基因的原核表达载体pET-DsbA ；以ρΕΤ-DsbA为出发载体构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体为 pET-DsbA-NS3 ；所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因位于原核表达载体pET-DsbA多克隆位点处的BagII和Nhe I限制性酶切位点之间。
9.根据权利要求7或8所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体为 BL21 (Rosetta)、BL21 (DE3)、BL21 (DE3, plysS)、E. coli JM109、E. coli HBlOl 或 E. coli ToplO，优选为BL21 (Rosetta)；以大肠杆菌BL21 (Rosetta)为出发菌株构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的工程菌为 BL21 (Rosetta)/DsbA_NS3。
10.权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白在牛病毒性腹泻病毒的ELISA检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与应用。本发明的融合蛋白是将BVDV非结构蛋白NS3优势区的氨基(N)端连接折叠酶DsbA后得到的。经过突变后的DsbA与BVDV非结构蛋白NS3优势区融合可实现NS3基因的胞内可溶性有活性的高表达，表达量大于30％。本发明融合蛋白的表达方法中采用携带T7启动子和DsbA基因的pET-DsbA表达载体，选用凝血酶切割位点作为BVDV非结构蛋白NS3优势区基因的插入位点，表达的牛病毒性腹泻病毒NS3免疫优势蛋白具有很好的抗原性，可用于牛病毒性腹泻病毒的ELISA检测。
文档编号C12N9/00GK102517260SQ20111044992
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者尹惠琼, 张启模, 杨姝, 王丽, 章金刚 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所