一种高效检测纳米颗粒心肌毒性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米颗粒毒性检测领域，具体涉及一种高效检测纳米颗粒心肌毒性的方法。
技术背景
[0002]在生物医药领域，纳米颗粒常常用作药物输送的载体，在使用纳米颗粒时，常需对其毒性进行评价。
[0003]心脏是人体的重要器官，一种纳米颗粒能否进行生物医用，其对心脏细胞毒性是重要的考察对象。
[0004]在现有技术中，评价纳米细胞的心肌毒性的常用方法为进行纳米颗粒毒性的动物实验。然而进行动物实验，所需检测周期长，同时常会由于实验动物的个体差异造成检测误差。现有技术中用于替代动物实验的体外实验，步骤繁琐，容易由于操作失误造成误差，精确度难以保证。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效检测纳米颗粒心肌毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
1)制备图案化纤维电纺接收板:先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状包括正方形、长方形中的一种，边长的范围为20 μπι-100 μ??;最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2)制备图案化电纺纤维:将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤I)所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备得到正方形或长方形组成的图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为100-300 nm ；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；
3)将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为40-150 μ m、高为70-100 ym的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4)将步骤2)和步骤3)所得物在O2或队的氛围下，用等离子体处理60秒，使得步骤
2)和步骤3)所得物紧密连接；
5)将5X16-L OX 17个小鼠原代心肌细胞接种于步骤4)所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4)所得物的腔体，流速为0.2-0.3 ml/h ;再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入，于纳米颗粒泵入后，记录小鼠原代心肌细胞跳动频率变化、超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性； 所述纳米颗粒包括纳米四氧化三铁、纳米二氧化钛、纳米氧化锌、纳米二氧化娃、纳米银颗粒中的一种。
[0006]本发明通过大量的实验摸索发现，当选用直径为100-300 nm的电纺纤维，并将纤维膜的图案设置为正方形或长方形阵列时，以及设置PDMS腔体的尺寸为宽为40-150 μ m、高为70-100 μ m时，可使得小鼠原代心肌细胞在腔体内很好的生长，并对纳米颗粒产生几乎与动物实验相同的毒性反应。
[0007]本发明可以使得图案化纤维和PDMS腔体和玻璃基底无缝紧密贴合，保证了纳米颗粒完全的与细胞接触，确保了检测的精确度。同时，由于图案化纤维膜紧密的与基底和腔体贴合，使得本发明可以具有很好的重复操作性，节省了检测的成本。
[0008]重要的是，任何根据本发明作出的可预计的改变，如微调图案形状和PDMS大小，均属于本发明的保护范围。
[0009]特别需要指出的是，本发明适用于检测纳米颗粒的心肌毒性。根据本领域的常识，应理解本发明适用于任何纳米颗粒的心肌毒性检测。应理解本发明所列举的几种纳米颗粒仅仅用于证明本发明适用于纳米颗粒的心肌毒性检测，不应理解为对本发明的限定。
[0010]本发明中，步骤I)沉积的金属银可以制备成任何形式的阵列，只需阵列中的图形为本发明所述的正方形或长方形即可。
[0011]优选的，所述步骤I)中沉积的金属银的形状为正方形，边长的范围为20 μπι-100μπι。当所沉积的金属银的形状为正方形阵列时，原代心肌细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的心肌毒性的检测。
[0012]所述步骤2)中，进行电纺时，电压为15-25 KV，流速为0.5-1.0 ml/ho
[0013]优选的，所述步骤2)中，纤维的直径为200 nm。当所用纤维的直径为200 nm时，原代心肌细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的心肌毒性的检测。
[0014]所述步骤2)中的医用高分子聚合物为聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮与二甲基甲酰胺的混合溶液，丙酮与二甲基甲酰胺的体积比为9:1。当纤维为聚乳酸纤维时，原代心肌细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的心肌毒性的检测。
[0015]优选的，所述步骤3)中的模具的宽为100 μπι，高为80 μπι。
[0016]更优选的，所述步骤3)中的模具的宽为50 μπι，高为70 ym。检测腔道越小，越集成化，可以实现一个检测装置具有多个腔道，实现更多组平行实验的进行，更加确保检测的精确度。在现有技术中，尚未发现可以制备如此小的、基于电纺纤维膜进行心肌毒性检测的腔体。
[0017]所述步骤5)中，用于接种的原代心肌细胞的数目为8X106个。
[0018]所述步骤5)中，培养基的流速为0.25 ml/ho
[0019]本发明的有益效果:
1、本发明可以实现高效、高精度的纳米颗粒心肌毒性检测，检测效果与体内动物实验一致；相对于体内动物实验更加快捷；
2、本发明所用原料易得，成本低，所用的技术成熟易实施，具有巨大的市场应用前景。
【附图说明】
[0020]图1为本发明所得图案化纤维。
【具体实施方式】
[0021]以下通过实施例的【具体实施方式】对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
[0022]实施例1
1)制备图案化纤维电纺接收板:先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为正方形阵列，边长的范围为20 y m ;最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2)制备图案化电纺纤维:将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤I)所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备正方形阵列的图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为100 nm ；
所述医用高分子聚合物为聚丙烯腈，所述有机溶剂为丙酮和二甲基甲酰胺混合溶液(9:1 v/v)；
3)将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为100μ m、高为80 μ m的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4)通过等离子处理:打开设备真空室，装入前面制备好的沉积有图案化电纺纤维的玻璃片和PDMS腔体，开启射频驱动源灯丝电源，开启O2:气瓶瓶阀，等离子体处理I分钟后，将步骤2)和步骤3)所得物紧密贴合，使其连接；
5)将8X16个小鼠原代心肌细胞接种于步骤4)所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4)所得物的腔体，流速为0.25 ml/h ;再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入，于纳米颗粒泵入后，记录小鼠原代心肌细胞的细胞跳动频率变化、超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒包括纳米银颗粒。
[0023]实施例2
1)制备图案化纤维电纺接收板:先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为长方形阵列，边长为20 μπι和70 ym，最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2)制备图案化电纺纤维:将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤I)所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备得到长方形阵