一种猪脑心肌炎病毒纳米pcr检测试剂盒及其检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪脑心肌炎病毒的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪脑心肌炎（Porcine encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒 (Encephalomyocarditis virus, EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍为主要 特征的人兽共患传染病。自从1958年从患心肌炎的病猪中分离到EMCV以来，随后世界上 一些养猪国家都曾有该病的发生、流行以及EMCV感染的报道，给养猪业造成了一定的经济 损失。我国从病原学和血清学方面已经证实在不少养猪生产地区的规模化猪场存在EMCV 的感染，对养猪生产潜在的危害受到关注。
[0003] EMCV的检测方法主要包括传统的病毒的分离、免疫荧光抗体染色、聚合酶链式反 应（PCR)等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵 敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对 复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题， 寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极其重要。
[0004] 纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为lnm~100nm的固相纳米 金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了 纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停 留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产 量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒的纳米PCR检测手段。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米 PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒。
[0006] 本发明所采取的技术方案是：一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒， 包括5X反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于 所述试剂盒还包括2XNan〇PCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No. 1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No. 2所示。
[0007] 引物是根据GenBank公布的猪脑心肌炎病毒序列，在其3D基因保守序列区域设计 的一对特异性引物。
[0008] 优选的，2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 组 成。
[0009] 优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。
[0010] 优选的，反转录引物的序列为SEQ ID No. 2所示。
[0011] 优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75% 乙醇。
[0012] 优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0013] 其中，阳性对照可为将猪脑心肌炎病毒接种BHK-21细胞后，收集24~48小时细 胞培养物。
[0014] 本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪脑心肌炎病毒 的产品中的应用。
[0015] 应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有猪脑心肌炎病毒的方法，包括如下步 骤： 1、病毒RNA的提取 (1)将250 ii L经过预处理的待测样品加入750 ii L TRIzol LS Reagent中，剧烈振荡 2 min，室温放置5 min。加入250 iiL氯仿，剧烈振荡lmin，室温放置5min后，4°C 12,000 rpm离心15 min，将上层水相转入新的离心管。（2)加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温 静置15 min, 4°C 12, 000 rpm离心15 min,轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇 700~800111，41：12,000卬111离心5 111111，弃上清。（3)将沉淀自然风干或于501：干燥箱 中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80°C备用。
[0016] 待测样品可为脑、心脏、淋巴结。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎 后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000~5000rpm离心5~10分钟后 取上清，之后再进行RNA的提取。
[0017] 2、反转录反应 取上述步骤所得的病毒总RNA 11 iiL，加入2 iiL 10剛的反转录引物（SEQ ID No. 2)， 4 U L 5X反转录缓冲液、0. 5 ii L反转录酶、0. 5 ii L RNA酶抑制剂、2 ii L dNTP Mixture 至20 ii L，42°C水浴1~2 h，即得到cDNA溶液。
[0018] 3、纳米PCR反应 在反应管中加入10 yL2XNanoPCRMix、l ilL上述cDNA溶液、0.5 ilLlO剛的上游 引物（SEQ ID No. 1)、0. 5 iiL 10MM的下游引物（SEQ ID No. 2)，最后加入无核酸酶水至总 体积为20 u L。
[0019] 混匀后按如下反应程序进行：94°C 3min，l个循环；94°C 10s，56°C 30 s，72°C 25 s，共30个循环；72°C 5 min 1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩 增产物，若出现425 bp大小的条带则待测样品含有猪脑心肌炎病毒。
[0020] 本发明提供了一对检测猪脑心肌炎病毒的特异性引物，利用其制成的纳米PCR试 剂盒，能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒。本发明可使PCR反应更快地达到目标温度， 减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高 了猪脑心肌炎病毒的检测效率，并有效提高了猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量，减少了 非特异性扩增，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1为猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测结果； M :DL2000 Marker ; 1 :阳性对照； 图2为猪脑心肌炎病毒纳米PCR敏感性检测结果； M: DL2000 Marker ;1~6依次为10°~1(T5倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7:阴性对 眧. >、、、? 图3为猪脑心肌炎病毒纳米PCR特异性检测结果。
[0022] M:DL2000 Marker ;1:猪脑心肌炎病毒；2:猪瘟病毒；3:猪捷申病毒；4 :猪肠道 病毒；5 :猪繁殖与呼吸综合征病毒；6 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0023] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所 给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 实施例1 一种检测猪脑心肌炎病毒的纳米PCR试剂盒最佳实施例 本实施例试剂盒包括：（1)猪脑心肌炎病毒RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、 异丙醇、75%乙醇；（2)反转录试剂：5X反转录缓冲液、浓度为2. 5 mM的dNTP Mixture、浓 度为2. 5 U/iiL的M-MLV反转录酶、浓度为30 U/iiL的RNA酶抑制剂和反转录引物；（3) 纳米PCR反应试剂：2XNanoPCR Mix、上游引物、下游引物；（4)其他：阳性对照和无核酸 酶水。其中，2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 组成，阳 性对照为将猪脑心肌炎病毒接种接种BHK-21细胞后，收集24~48小时细胞培养物，引物 为冻干粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。
[0025] 表1引物序列
【主权项】
1. 一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括5X反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2 XNanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No. 1所示，所述下游引物的序列 为 SEQ ID No. 2 所示。
2. 根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所 述 2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 组成。
3. 根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所 述反转录酶为M-MLV反转录酶。
4. 根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所 述反转录引物的序列为SEQ ID No. 2所示。
5. 根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所 述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。
6. 根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所 述试剂盒还包括阳性对照。
7. 如权利要求1~6任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪脑心肌 炎病毒的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。该试剂盒可用于检测猪脑心肌炎病毒。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行猪脑心肌炎病毒检测的方法，能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒，大大提高了猪脑心肌炎病毒的检测效率及猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93
【公开号】CN104673937
【申请号】CN201510096905
【发明人】袁万哲, 孙继国
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月5日