锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及水产养殖业的检测方法，具体涉及一种锦 鲤疱疫病毒（KHV)的RT-LAMP(Real-TimeLoop-mediatedIsothermalAmplification， 恒温实时荧光扩增反应）检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus, KHV)引起的锦鲤 (Cyprinus carpio koi )和鲤鱼（Cyprinus carpio carpio)的一种高致病性疾病。该病 多发生在水温为18~28°C的春秋季节，具有高度传染性，发病率和死亡率均可高达80%~ 100%。由于缺乏相关的检疫制度，所以锦鲤和鲤鱼的国际贸易促进了该病在世界范围内的 暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成了破坏性影响。该病最初在德国报道，后主要在欧洲 的锦鲤养殖中广泛传播，是国际动物卫生组织（0IE)规定需要向0IE申报的疾病之一。在 我国也被列为《中华人民共和国动物防疫法》第十条规定中的二类动物疫病。
[0003] KHV属于疱疹病毒科，为直径100~110nm的二十面体，有囊膜，KHV是线形双股DNA 病毒，是鱼类疱疫病毒，属中基因组最大的病毒。基因组大小为295kb，全部核苷酸的GC含 量为59. 2%。目前，已分离到4株病毒，即欧洲株、美国株（KHV-U)、亚洲株（KHV-J)和以色 列株（KHV-I)。。KHV在22°C左右的池塘水中至少存活4 h，并且在鱼的分泌物或池塘底泥中 可能存活更长时间。病毒对温度和酸碱度都比较敏感，在35°C 2天或60°C 30min以及pH 低于3或高于11的条件下，病毒失去感染力。氯仿、250mL/ L的乙醚或lg/L的TritonX-100 可迅速灭活病毒。感染KHV的鱼典型临床症状是反应迟钝、食欲不振、呼吸困难、共济失调； 鳃出血坏死，眼睛凹陷，皮肤有灰白色斑点，黏液分泌增多；感染后第7~10天开始出现死 亡,2~3周后死亡率可达100%。
[0004] 目前，采取细胞培养锦鲤疱疹病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太 长，采取PCR检测方法需要昂贵的设备和专业的操作水平，因此建立一种快速、准确、高通 量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引 物，其核苷酸序列分别如下所示： 外引物： KHV-F3 ：AGTCACCAAAGCTCAACTG (SEQ ID N0:1)； KHV-B3 ：GATTCCGATGCCGATGAA (SEQ ID N0:2)； 内引物： KHV-FIP ：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC (SEQ ID NO:3)； KHV-BIP ：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG (SEQ ID N0:4)； 环引物： KHV-LF ：CTTGACGAGGAGCTTGCT (SEQ ID NO:5)； KHV-LB ：GCACGCCATGTACTCCAA (SEQ ID NO:6)〇
[0009] 一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述所述的检测引 物组。
[0010] 进一步的，上述检测试剂盒包含上述所述的引物组、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、 阳性对照和阴性对照。
[0011] 进一步的，上述外引物、内引物、环引物的摩尔比为1 :8 :4。
[0012] 进一步的，上述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0013] 进一步的，上述RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、 150mM MgSCVK溶液和 10XSYT0-9 溶液。
[0014] 进一步的，上述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
[0015] 一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤： 1) 待检样品DNA的提取； 2) 恒温实时荧光扩增反应：配制25111反应体系，含有1(狀43 0.211|1，1(狀-83 0? 2 ii M，KHV-FIP 1. 6 ii M，KHV-BIP 1. 6 ii M，KHV-LF 0? 8 ii M，KHV-LB 0? 8 ii M，RT-LAMP 反应 液13. 0iil，DNA聚合酶8U，待检DNA l~100ng，用DEPC水补齐到25iil ;然后于63~65°C 反应60~90min ; 3) 结果分析：根据有无S型扩增曲线来判断检测结果； 上述所用到的所有试剂均来自权利要求2~7任一所述的检测试剂盒； 上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果： 1) 高特异性： 本发明根据锦鲤疱疹病毒（KHV)的主要包膜蛋白基因（mr基因，GenBank登录号为 AB195965. 1)设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域 中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二 聚体概率低，保证了反应的顺利进行； 2) 高灵敏度：最低检测极限可达到lpg /ul KHV DNA ; 3) 快速高效：整个扩增只用60~90min即可完成，扩增产量可达109~10 1(1个拷贝； 4) 操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等 繁琐步骤，只需要恒温荧光检测仪器，条件比较温和； 5) 结果易读：通过便捷式的恒温荧光检测仪器即可判读检测结果，无需电泳等其他任 何分析步骤，适合非专业人士的现场检测。
【附图说明】
[0017] 图1是实施例3特异性的检测结果图（1、2 :DEPC水对照；3、4 :KHV DNA ;5、6 :CW DNA ;7、8 :CyHV-l DNA ;9、10 :CyHV-2 DNA); 图2是实施例4灵敏度的检测结果图（KHV DNA，1 :100ng/ul DNA(KHV) ;2 :10ng/ul DNA(KHV) ；3：lng/ul DNA(KHV) ；4 ：100pg/ul DNA(KHV) ；5 ：10pg/ul DNA(KHV) ；6 ：lpg/ul DNA(KHV) ;7:100fg/ul DNA(KHV) ;8:DEPC 水对照）。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 实施例1锦鲤疱疹病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立 锦鲤疱疫病毒的 RT-LAMP (Real -Time Loop-mediated Isothermal Amplification， 恒温实时荧光扩增反应）检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、聚合 酶、阳性对照和阴性对照。
[0020] (1) RT-LAMP引物设计：以锦鲤疱疹病毒（KHV)的主要包膜蛋白基因（mr基因， GenBank登录号为AB195965. 1)为靶基因，利用在线设计KHV特异性RT-LAMP引物。引物 序列见表1。
[0021] 表1. KHV特异性的RT-LAMP弓丨物序列表
【主权项】
1. 一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环 引物，其核苷酸序列分别如下所示： 外引物： KHV-F3 ：AGTCACCAAAGCTCAACTG (SEQ ID N0:1)； KHV-B3 ：GATTCCGATGCCGATGAA (SEQ ID N0:2)； 内引物： KHV-FIP ：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC (SEQ ID NO:3)； KHV-BIP ：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG (SEQ ID N0:4)； 环引物： KHV-LF ：CTTGACGAGGAGCTTGCT (SEQ ID NO:5)； KHV-LB ：GCACGCCATGTACTCCAA (SEQ ID N0:6)〇
2. -种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括权利要 求1所述的检测引物组。
3. 根据权利要求2所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测 试剂盒包含权利要求1所述的引物组、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
4. 根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、 内引物、环引物的摩尔比为1 :8 :4。
5. 根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA 聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6. 根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所 述RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgSOyK溶液和 10XSYT0-9 溶液。
7. 根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳 性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
8. -种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 待检样品DNA的提取； 2) 恒温实时荧光扩增反应：配制25iil反应体系，含有KHV-F3 0. 2iiM，KHV-B3 0? 2 ii M，KHV-FIP 1. 6 ii M，KHV-BIP 1. 6 ii M，KHV-LF 0? 8 ii M，KHV-LB 0? 8 ii M，RT-LAMP 反应 液13. 0iil，DNA聚合酶8U，待检DNA l~100ng，用DEPC水补齐到25iil ;然后于63~65°C 反应60~90min ; 3) 结果分析：根据有无S型扩增曲线来判断检测结果； 上述所用到的所有试剂均来自权利要求2~7任一所述的检测试剂盒； 上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
【专利摘要】本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒RT-LAMP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对环引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶和阴阳性对照。其检测方法是通过提取待检病毒DNA，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，通过便捷仪器恒温荧光检测仪器观察是否有无S型扩增曲线，确定待检样品中是否含有锦鲤疱疹病毒（KHV）DNA。本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各级检测单位和水产养殖用户中进行推广应用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70
【公开号】CN104673934
【申请号】CN201510073315
【发明人】刘助红, 邱德义, 张璜, 陈洵, 石磊
【申请人】中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 广州迪澳生物科技有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月10日