松材线虫pcr检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种松材线虫PCR检测试剂盒及其 检测方法。
【背景技术】
[0002] 松材 线虫(North American pinewood nematode ；Bursaphelenchusxylo philus)，该线虫属蠕形动物门、线虫纲、垫刃目、滑刃总科、伞刃属。线虫成虫虫体长约1毫 米，雌虫尾部近圆锥形，末端圆；雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫病又称松枯萎病， 是一种毁灭性虫害。它是通过松墨天牛（Monochamusalternatus)等媒介昆虫传播于松树 体内，从而引发松树病害。被松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂 分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂。
[0003] 目前在松材线虫的分子检测方面，主要包含三大类。第一类是普通PCR检测方 法，如专利申请号为200310106109. 5的"松材线虫检测试剂盒及其检测方法"等，这些 检测方法费时长、检测过程复杂，不便于生产上应用，且未应用于实际生产中；第二类是 实时荧光PCR检测方法，如专利申请号为200310109374. 9的"一种检测松材线虫的方法 及其专用引物和探针"等，这些检测方法或多或少地存在检测特异性不强问题，且检测精 度还有待提高，因而也没有在生产实践中应用；第三类是恒温扩增检测技术，如专利号为 201210303532. 3的"一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法"，该项检测技术还有待 生产上的验证。
[0004] 综上，上述松材线虫分子检测方法，都难以满足各森林植物检疫检查站的快速检 疫需求。从快速检疫的角度而言，上述松材线虫检测技术与方法距离快速检疫还有一定的 差距，为满足检疫实践的快速鉴定要求，有必要开发更为简便、快速、高效的检测鉴定技术 与方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种松材线虫PCR检测试剂盒及其 检测方法，采用聚合酶链式反应（PCR)及Taqman荧光探针技术对松材线虫基因中高保守特 异性核酸序列进行扩增检测，以实现对松材线虫的存在进行判断，进而实现对松材线虫感 染的辅助诊断。
[0006] 为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种松材线虫PCR检测试剂盒，包括 待测的DNA靶基因和PCR反应液，所述PCR反应液中包括所述引物A和荧光探针A，所述引 物A分为上游引物A和下游引物A，
[0007] 所述DNA靶基因的核苷酸序列为：
[0008] CCGTTTGGTGATGTTGTTTCAACGGCGCGGCCGTCAGGGACGTTCGGATGAGAATGTTTGGAGTCCTGG CTGCGGTTTGTTGAGCTTCGTCGTGAAGCCTTGC ；
[0009] 所述上游引物A的核苷酸序列为：5' -CCGITTGGTGATGITGmCA-3' ；
[0010] 所述下游引物A的核苷酸序列为：5' -GCAAGGCTTCACGACGAA-3' ；
[0011] 所述荧光探针 A 的核苷酸序列为：5' -FAM-CTCAACAAACCGCAGCCAGGACTC-BHQ-3'。
[0012] 优选地，还包括：
[0013] DNA提取液，按十二烷基硫酸钠1 %、乙基苯基聚乙二醇0. 5%、曲拉通x-1000. 2% 浓度配制成所述DNA提取液，充分混匀后按lmL/管分装；
[0014] tap酶：浓度 5u/ul，包括 10XPCRBuffer、25mmol/LMgCl2;
[0015] UNG酶：浓度>lu/y1 ;
[0016] dNTPs :在室温下，按体积分别为 100ul: 100ul: 100ul: 100ul: 550ul加入 dATP、dCTP、dGTP、dUTP和超纯水，搅拌混匀；
[0017] 阳性对照：106copies/mL~107copies/mL含目的片段质粒，0? 5mL/管分装；以及
[0018] 阴性对照：组成为1 X TE溶液。
[0019] 优选地，所述1XTE溶液的配制：称取0. 12114g的Tris，0. 292g EDTA加入已含 60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗 涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HC1调pH值为8. 0,最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量 瓶使之充分混匀。
[0020] 优选地，还包括一GAPDH内参照基因，所述内参照基因包括引物B和荧光探针B，所 述引物B分为上游引物B和下游引物B，
[0021] 所述上游引物B的核苷酸序列为：5' -TATGACAACAGCCTCAAGAT-3' ；
[0022] 所述下游引物B的核苷酸序列为：5' -AGTCCTTCCACGATACCA-3' ；
[0023] 所述荧光探针 B 的核苷酸序列为：5' -HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-B HQ-3,〇
[0024] 优选地，所述荧光探针A的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ淬灭基团；所 述荧光探针B的5 '端标记HEX荧光基团，3 '端标记BHQ淬灭基团。
[0025] 本发明还揭示了一种松材线虫PCR检测方法，包括以下步骤：
[0026] S1，取一定量的所述PCR反应液、Taq UNG酶加入一个离心管中振荡混匀，瞬时离 心后，分装到复数管PCR反应液管中，盖上管盖备用；
[0027] S2,制备待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本，并将制备好的所述待测样 本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后、干浴、离心，上清液用于PCR扩增；
[0028] S3,向准备好的所述PCR反应液管中分别加入所述上清液待测样品、阴性对照样 品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时离心后，将其放置于PCR仪上，编辑样本信息按照相应 的循环参数进行扩增反应；
[0029] S4,根据相应的质控标准分析检测结果。
[0030] 优选地，所述待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本的制备：
[0031] 阴性对照样本：取出所述阴性对照，8000r/min离心，吸取100 y 1至1. 5ml灭菌离 心管中，加入20 y 1所述内参照；
[0032] 阳性对照样本：取出所述阳性对照，8000r/min离心，吸取100y1至1. 5ml灭菌离 心管中，加入20 y 1所述内参照；
[0033] 待测DNA样本：用生理盐水充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签，将盛有棉 签洗涤液的离心管，13000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入所述DNA提取液，备用。
[0034] 优选地，所述步骤SI :确定需要进行的反应管数n，将nX44. 3 y 1松材线虫PCR反 应液，nXO. 5 y 1热启动Taq酶和nXO. 2 y 1UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离 心后，向每一个PCR反应液管中分装45 y 1，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4°C冰箱备 用。
[0035] 优选地，所述循环参数包括：
[0036] 第一阶段 50°C，扩增 2min ;
[0037] 94°C，扩增 5min;
[0038] 第二阶段 94°C，扩增 15s ;
[0039] 62°C，扩增 30s;
[0040] 72°C，扩增 20s;
[0041] 循环40次。
[0042] 优选地，所述质控标准为同时满足阳性质控和质控时，实验有效，否则无效，
[0043] 所述阴性质控为：FAM通道Ct值=40或"NoCt"或"undet. "，内参照HEX通道Ct 值 < 40 ;
[0044] 所述阳性质控：FAM通道Ct值彡35,且有相应的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct 值 < 40。
[0045] 本发明的有益效果是：
[0046] 1、本发明试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短（1~2小时），结果客观 可靠，仪器自动收集和分析数据，最低检出限为102 C〇pieS/mL，具有灵敏度高和特异性高等 优点。
[0047] 2、本发明试剂盒使用了大肠杆菌磷酸脱氢酶基因（GAPDH基因）作为内参照基因， 它在松材线虫基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反 应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
【附图说明】
[0048] 图1是本发明松材线虫PCR检测方法的流程示意图；
[0049] 图2是本发明松材线虫基因灵敏度检测结果示意图；
[0050] 图3是本发明松材线虫基因精密度结果示意图；
[0051] 图4是本发明松材线虫基因特异性结果示意图。
【具体实施方式】
[0052] 下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0053] 本发明揭示了一种松材线虫PCR检测试剂盒和检测方法，采用PCR反应及Taqman 荧光探针技术对松材线虫基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断松材线虫 的存在与否，指导战地医生对松材线虫感染的病人用药，帮助愈后判断。
[0054] 内参照原理：本发明试剂盒设置了内参照，该内参照为含管家基因：磷酸脱氢酶 基因（GAPDH基因）的质粒，GAPDH基因是一种管家基因，在人体细胞中能稳定表达，进行松 材线虫核酸提取时，能同步有效得到，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR 抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操 作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了；但当目的基因 结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正 常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。
[0055] 阳性对照原理：每次