一种定量检测固态发酵产物中酚类化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种定量检测固态发酵产物中酪类化合物的方法，具体设及固态发酵 产物的样品前处理及定量分析酪类化合物的方法，属于固态发酵产物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 酪类化合物也称为芳香族化合物，酪类化合物是饮料酒的香味组成部分，对于酒 的闻香、口味及稳定性等方面均具有重要的作用。挥发性酪类化合物在白酒中的含量极少， 但呈香作用却很强，在几百万分之一甚至千万分之一就能使人感觉到强烈的香气。有些挥 发性酪类物质被描述为"酪味"、"动物臭味"和"马底味"等异味，有些挥发性酪类物质当其 含量高于某个限值时，会使酒中产生腥异味，掩盖酒的香味。因此，控制饮料酒中酪类化合 物的含量对于稳定产品质量和品质非常重要。
[0003] 然后，对于白酒来说，白酒中的酪类物质基本上均在固态发酵过程中产生，为了进 一步探索该些酪类物质的产生来源、形成机理、代谢途径等，进而从酿造工艺上调控挥发性 酪类物质的含量，从而达到控制终产品中酪类化合物含量的目的，建立"一种定量检测固态 发酵产物中酪类化合物的方法"显得尤其必要。
[0004] 近年来，国内各白酒企业或高校科研院所对白酒中的挥发性酪类物质的测定方法 进行了研究分析，但目前尚没有关于固态发酵过程产物，如大曲、酒酷、鲁泥发酵过程等的 酪类化合物的定量分析方法。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一种检测固态发酵产物中10种酪类化合物的定 量分析方法。
[0006] 本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
[0007] 本发明定量检测固态发酵产物中酪类化合物的方法，其特点在于按如下步骤进 行；首先对待测固态发酵产物进行超声萃取、离屯、取上清液置于顶空瓶中，并加入2, 6-二 甲基苯酪内标溶液，通过顶空固相微萃取方式吸附富集目标物，最后通过气相色谱-质谱 联用技术对待测固态发酵产物中所含酪类化合物进行定性（W碎片的丰度比定性）、定量 分析。其中所述酪类化合物包括苯酪、4-甲基苯酪、4-己基苯酪、愈创木酪、4-甲基愈创木 酪、4-己基愈创木酪、4-丙基愈创木酪、4-己締基愈创木酪、2, 4-二叔了基苯酪和2, 6-二 叔了基苯酪。具体按如下步骤进行；
[0008] (1)超声萃取；称取5.0~10.Og待测固态发酵产物于25血栋色具塞试管中，加 入25mL体积浓度为10~15%的己醇溶液，旋紧塞子，在避光密闭条件下充分振荡混匀后， 超声萃取20~30min，然后采用低温离屯、方式分离收集上清液，离屯、温度5~10°C，离屯、转 速 8000 ~10000巧m，离屯、10 ~15min;
[0009] 似顶空固相微萃取：取8~10血所述上清液置于20血顶空瓶中，加入10化 的2, 6-二甲基苯酪内标溶液，立即密闭顶空瓶，轻轻摇匀，然后在50~55°C恒温预热3~ 5min后，将PA萃取头插入所述顶空瓶中，于50~55°C恒温萃取30~40min;
[0010] (3)气相色谱-质谱联用：在顶空固相微萃取结束后，将PA萃取头插入到联有质 谱检测其的气相色谱进样口，230~250°C热解析3~5min ;
[0011] 气相色谱条件为：
[0012] 色谱柱为DB-WAX毛细管柱 60mX0. 25mmX0. 25ym;
[0013]进样口温度230~250°C，质谱检测器温度230°C，载气He,流速0.8~1血/min， 不分流进样；
[0014]程序升温条件为初始柱温40°C，W4~5°C/min上升至180°C，保持2~4min，然 后W5~6°C/min升温到230°C，保持5~15min;
[0015] 质谱条件为：
[0016] 气相色谱与质谱接口温度为230°C ;
[0017] 电离方式为电子轰击源EI;
[0018] 监测方式为选择性离子扫描模式SIM，电离能量70eV;
[0019] 溶剂延迟为20~25min;
[0020] (4)标准曲线的建立
[0021] a、配制单标储备液；称取各种酪类化合物标准品，分别用无水己醇配制成1~ 2mg/L的单标储备液，采用栋色储液瓶于4°C冰箱中避光保存；
[0022]b、配制混合标准储备液：吸取各酪类化合物的单标储备液0.5mL混合，然后采用 色谱纯无水己醇定容至50mL栋色容量瓶，获得混合标准储备液，于4°C冰箱中避光保存；
[0023]C、配制混合标准使用液：分别吸取混合标准储备液0. 05血、0. 1血、0. 2血、0. 5血、 1血至50血栋色容量瓶中，加入己醇，然后用超纯水定容，配制成己醇体积浓度为10%~ 15%的标准系列溶液；
[0024]t对各混合标准使用液按步骤（2)、（3)进行处理，W各酪类化合物标准品与内标 物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，W各酪类化合物标准品与内标物的浓度之比为纵坐 标绘制标准曲线；
[0025] (5)待测固态发酵产物的测定；将待测固态发酵产物按步骤（1)进行超声萃取，按 步骤（2)进行顶空固相微萃取，然后按照步骤（3)气相色谱-质谱联用进行定性定量分析， 通过标准曲线计算固态发酵产物中酪类化合物含量。
[0026] 所述2, 6-二甲基苯酪内标溶液是W内标物质2, 6-二甲基苯酪溶于色谱纯无水己 醇中获得，所述2, 6-二甲基苯酪内标溶液的溶度为70~90mg/L。
[0027] 10种酪类化合物和内标物的分离质谱图见图1。10种酪类化合物的定量，是W 2,6-二甲基苯酪为内标，在20^3/1~400 ^3/1或400 ^3/1~4000 ^3/1的检测范围内 具有良好的线性关系，线性相关系数R2均大于或等于0. 99。具体详见表1。
[002引表1酪类物质标准曲线线性方程及相关系数
[0029]
【主权项】
1. 一种定量检测固态发酵产物中酚类化合物的方法，其特征在于按如下步骤进行：首 先对待测固态发酵产物进行超声萃取、离心取上清液置于顶空瓶中，并加入2, 6 -二甲基苯 酚内标溶液，通过顶空固相微萃取方式吸附富集目标物，最后通过气相色谱-质谱联用技 术对待测固态发酵产物中所含酚类化合物进行定性、定量分析。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酚类化合物包括苯酚、4-甲基苯酚、 4-乙基苯酚、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-丙基愈创木酚、4-乙烯基愈 创木酚、2, 4-二叔丁基苯酚和2, 6-二叔丁基苯酚。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于按如下步骤进行： (1) 超声萃取：称取5. O~10.0 g待测固态发酵产物于25mL棕色具塞试管中，加入 25mL体积浓度为10~15%的乙醇溶液，旋紧塞子，在避光密闭条件下充分振荡混匀后，超 声萃取20~30min，然后采用低温离心方式分离收集上清液，离心温度5~KTC，离心转速 8000 ~lOOOOrpm，离心 10 ~15min ; (2) 顶空固相微萃取：取8~IOmL所述上清液置于20mL顶空瓶中，加入IOyL的 2, 6-二甲基苯酚内标溶液，立即密闭顶空瓶，轻轻摇匀，然后在50~55°C恒温预热3~ 5min后，将PA萃取头插入所述顶空瓶中，于50~55°C恒温萃取30~40min ; (3) 气相色谱-质谱联用：在顶空固相微萃取结束后，将PA萃取头插入到联有质谱检 测仪的气相色谱进样口，230~250°C热解析3~5min ; 气相色谱条件为： 色谱柱为DB-WAX毛细管柱60mX0. 25mmX0. 25 ym ; 进样口温度230~250°C，质谱检测器温度230°C，载气He，流速0. 8~lmL/min，不分 流进样； 程序升温条件为初始柱温40°C，以4~5°C /min上升至180°C，保持2~4min，然后以 5~6°C /min升温到230°C，保持5~15min ; 质谱条件为： 气相色谱与质谱接口温度为230°C ; 电离方式为电子轰击源EI ; 监测方式为选择性离子扫描模式SIM，电离能量70eV ; 溶剂延迟为20~25min ; (4) 标准曲线的建立 a、 配制单标储备液：称取各种酚类化合物标准品，分别用无水乙醇配制成1~2mg/L的 单标储备液，采用棕色储液瓶于4°C冰箱中避光保存； b、 配制混合标准储备液：吸取各酚类化合物的单标储备液0. 5mL混合，然后采用色谱 纯无水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，获得混合标准储备液，于4°C冰箱中避光保存； c、 配制混合标准使用液：分别吸取混合标准储备液0. 05mL、0. lmL、0. 2mL、0. 5mL、lmL 至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超纯水定容，配制成乙醇体积浓度为10%~15% 的标准系列溶液； d、 对各混合标准使用液按步骤（2)进行顶空固相微萃取，然后按照步骤（3)进行分析， 以各酚类化合物标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，以各酚类化合物标准 品与内标物的浓度之比为纵坐标绘制标准曲线； (5)待测固态发酵产物的测定：将待测固态发酵产物按步骤（1)进行超声萃取，按步骤 (2)进行顶空固相微萃取，然后按照步骤（3)气相色谱-质谱联用进行定性定量分析，通过 标准曲线计算固态发酵产物中酚类化合物含量。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述2, 6-二甲基苯酚内标溶液是以内标 物质2, 6-二甲基苯酚溶于色谱纯无水乙醇中获得，所述2, 6-二甲基苯酚内标溶液的溶度 为 70 ~90mg/L。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测固态发酵产物为大曲、酒醅或窖 泥。
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测固态发酵产物中酚类化合物的方法，属于固态发酵产物分析技术领域，主要适用于白酒固态发酵产物，包括大曲、酒醅、窖泥的酚类化合物的含量测定；具体涉及固态发酵产物的超声萃取、顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用进行定性、定量分析。本发明建立的方法能够快速检测并准确定量固态发酵产物中10种挥发性酚类化合物，各酚类化合物在所测范围内具有良好的线性关系R2>0.99，检出限均小于10ug/L，相对标准偏差小于10％，回收率为75％～110％；本发明的技术方案简便快速，能实现对固态发酵过程产物中酚类化合物的有效监控，对于提升终产品的品质具有重要意义。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104865338
【申请号】CN201510324311
【发明人】高江婧, 刘国英, 汤有宏, 姜利, 徐祥浩, 李安军, 周庆伍, 梁金辉
【申请人】安徽古井贡酒股份有限公司, 安徽瑞思威尔科技有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日