[0089] 5. S株P46基因部分测序及序列结果
[0090] S株P46的PCR产物进行测序，双向测通测序碱基序列为（序列7):
[0091]
[0094]
[0095] *序列中黑体部分的氨基酸为：由TGA编码的色氨酸，在通用密码子中TGA为终止 密码子。
[0096] 通过NCBI网站上的BLAST软件在线分析，结果表明以上核酸序列与猪肺炎支原体 国际标准菌株232株（12个碱基有差别）、J株（10个碱基有差别）、7448株（14个碱基有 差别）等的相应区域的同源性均达99% ;氨基酸序列上同源性更高，与7448株仅相差一个 氨基酸（221位Q-A)，与232株相差两个氨基酸（182位G-Q和221位Q-A)。
[0097] 6.结论
[0098] 通过猪肺炎支原体S株P46部分基因测序结果看，与其他菌株的相应序列同源性 较高，核苷酸序列和氨基酸序列均达到99%的同源性，这与P46基因的高度保守性特点相 符。
[0099] 实施例5
[0100] --S株的P97基因 Rl区测序
[0101] 1.引物设计：
[0102] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体232株的P97基因 Rl区的核苷酸序列，设 计合成1对引物，扩增片段包含了 Rl区的全长，232株扩增产物预计大小约为320bp，不同 菌株扩展片段长度有差异。
[0103] 上游引物 P1 序列为：5' -CAAAAGAAGG TAAAAGAGAA-3'（序列 9)
[0104] 下游引物 P2 序列为：5' -AAGCCAGTAT TAGTAGCAAC-3'（序列 10)。
[0105] 2.模板提取
[0106] 取S株菌液lmL，进行12000rpm离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I IXTEN溶液 悬浮，沸水浴lOmin，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0107] 3. PCR 扩增
[0108] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMixlO μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 lOmin。
[0109] 4.电泳凝胶成像
[0110] 扩增产物经I. 〇%琼脂糖凝胶电泳，结果表明S株的扩增片段大小约为180bp，见 图4。
[0111] 5. P97基因的部分测序及序列结果
（序列11)
[0115] *序列中有下划线的氨基酸为重复序列，共计11个Ala Ala(ValZThr)Lys Pro Glu(Val)重复，简写为 AA (V/T)PKE/V。
[0116] 猪肺炎支原体S株的P97基因的Rl区共计包含11个AA(V/T)PKE/V的氨基酸序 列重复，区别于其他菌株，与168株重复数相同，但其中有多达7个氨基酸的差别，如下表1。
[0117] 表1四株猪肺炎支原体P97基因的Rl区氨基酸序列的差异
[0118]
[0119] 注表示缺失；下划线表示与S株在该处不同。
[0120] 实施例6
[0121] 一一猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）的制备及检验
[0122] 1.菌液培养
[0123] 将猪肺炎支原体S株冻干菌种用猪肺炎支原体LPS培养基复溶，1:10接种猪肺炎 支原体LPS培养基，37°C培养72~96小时，当溶液颜色呈棕红色（pH至6. 6~6. 8)，均匀 浑浊无沉淀，收获菌液。将S株菌液连续在LPS培养基上传代2代，使活菌数达109(XU/mL， 无菌检验合格后菌液用于制备疫苗。
[0124] 2.制备疫苗
[0125] 将检验合格的S株菌液灭活后，与佐剂（法国赛比克公司的油佐剂或水佐剂）混 合进行乳化制苗，疫苗含菌量可达5 X 108CCU/mL，制备成猪肺炎支原体灭活疫苗疫苗。
[0126] 3.疫苗检验
[0127] 3. 1性状检验疫苗外观应呈乳白色乳剂。
[0128] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩 散。
[0129] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相应 不多于0. 5mL。
[0130] 粘度按照现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会编。中华人民共和国兽药典2010 年版三部中国农业出版社，2011年，本发明以下称《中国兽药典》）进行，应符合规定。
[0131] 3.2无菌检验按照现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。
[0132] 3. 3安全检验
[0133] 小鼠每批疫苗腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，0. 5mL/只，观察10日，观察小 鼠存活情况。
[0134] 仔猪每批疫苗肌肉注射7日龄仔猪5头，2mL/头，首免后14日，再次肌肉注射2mL， 观察30日，观察仔猪存活情况及有无副反应，并分别于免疫0日、7日和二免后7日连续测 体温，观测体温情况。
[0135] 3.4效力检验
[0136] 仔猪抽取1批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）和1批国外进口疫苗分别肌肉注射 7日龄健康易感SPF仔猪5头，ImL/头，14日后再肌肉注射疫苗lmL。首次免疫后21日，连 同对照猪5头，各用猪肺炎支原体ZS株组织强毒气管注射，每头5mL (含40~200个最小 发病剂量）。攻毒28日后，剖检，观察猪肺部病变情况，使用55计分法进行判定
[0137] 家兔将3批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）肌肉注射1.5~2kg家兔5只，0.1 mL/ 只，14日后再次肌肉注射疫苗0. lmL，另设5只对照。在首免后21日采血，测定血清IHA抗 体效价，对照兔IHA效价不高于1:10,免疫兔的IHA效价至少4只不低于1:40。
[0138] 4.结果
[0139] 4. 1性状检验
[0140] 外观乳白色乳剂。
[0141] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，呈云雾状扩散。
[0142] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相不 多于0. 5mL。
[0143] 粘度按照现行《中国兽药典》，使用粘度仪进行测定，粘度值（CP)分别为26,均符 合规定。
[0144] 4.2无菌检验抽取2瓶进行无菌检验，观察7日，均无菌生长。
[0145] 4. 3安全性检验结果
[0146] 3批疫苗分别腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，观察10日，小鼠均健活；超剂 量肌肉注射仔猪，观察30日，仔猪均健活，除注射部位出现轻微红肿，无其他副反应；
[0147] 首次注射疫苗后4~5日每组各猪体温略有升高，持续1~3日后均恢复正常，二 免后体温反应集中在注射后第1日，随及恢复正常。
[0148] 4.4效力检验结果
[0149] 4. 4. 1家兔效力检验结果
[0150] 表2家兔免疫后抗体IHA效价测定结果的比较
[0151]
[0152] 从上表可以看出，猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）免疫家兔后，IHA抗体效价可达 到1:40以上，与对照组差异显著，综合抗体水平略高于同类进口疫苗抗体水平。
[0153] 4. 4. 2仔猪免疫攻毒效力检验结果
[0154] 表3仔猪攻毒后肺部病变情况的比较
[0155]
[0156] 免疫攻毒试验结果表明猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）具有较强的免疫保护力，达 80%以上的水平，与进口同类疫苗差别不明显。
【主权项】
1. 一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该株猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)命名为S株，已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏号 CGMCC No. 10095。2. 权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株的P46基因的部分碱基 序列为：3.权利要求1所述猪一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株P97基因的Rl区碱基 序列为：对应的氨基酸序列为：4.权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产菌 株用于制备猪肺炎支原体疫苗。
【专利摘要】本发明涉及一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)菌种，S株，该菌株为猪肺炎支原体新分离株，可在无细胞培养基上稳定生长，生长滴度可达到109～1010CCU/mL，经家兔和仔猪免疫试验证实其免疫原性良好；该菌株P97基因的R1区氨基酸含有11个AA(V/T)PKE/V的连续氨基酸序列，可作为其独特的分子生物学标记，该株猪肺炎支原体菌种可用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。CGMCC No.1009520141201
【IPC分类】A61K39/02, A61P31/04, C12N1/20
【公开号】CN104894009
【申请号】CN201510249939
【发明人】沈青春, 冯忠泽, 吴金, 孙晔, 李秋菊, 李聪研, 魏晶晶, 宋潇婷, 孙亚波, 史文艳
【申请人】北京中海生物科技有限公司, 吉林和元生物工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日