制备猪支原体的重组表面抗原及其疫苗的方法

专利名称:制备猪支原体的重组表面抗原及其疫苗的方法
本发明是关于猪支原体表面抗原;涉及以重组DNA的方法制备该抗原在此抗原的基础上，制备猪支原体疫苗的方法;关于用此疫苗防治猪地方性兽病肺炎的处理方法，此外，在此抗原或此抗原的抗体的基础上，本发明还涉及用以发现猪群中猪支原体感染的诊断方法。
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是猪地方性兽病肺炎的病原，造成世界范围内猪的重要疾病。该病为慢性过程，非致命性疾患，各年龄组的猪都可得病，受感染的猪仅有轻度咳嗽和发烧的症状。但此种感染的经济影响是很大的，因为实际进食的减少，体重增加的减低，成为市场上的小个儿猪，致使蒙受重大经济损失。迄今，用疫苗控制此病或建立隔离病原猪群的努力尚未获得成功。
支原体与宿主细胞表面的物理性连接，是地方性兽病肺炎持久存在与发展的基础。如今在检定出猪肺支原体的媒介贴附宿主细胞的表面蛋白组分及其在感染过程中刺激自然生成抗体的基础上，提出抗地方性兽病肺炎的疫苗和对地方性兽病肺炎的诊断方法。
检定出上述表面蛋白DNA顺序编码后，可用适宜的表地载体，组成重组DNA分子，并将此重组DNA分子将适宜的宿主转化(例如，原核性或真核性宿主)。然后培养转化宿主，使其表达DNA顺序并制造出理想的支原体表面蛋白。
继之，将产生和分离出的表面蛋白与其它活性成分或它们的组合物，给猪注射，给药量应足够刺激抗体的生成，从而提供一种免疫猪，抗猪肺炎支原体感染的方法。这种疫苗的有效载体和适宜的给药方式，在兽医技术操作中是人所共知的。
本发明的表面抗原也是用于创造检测猪群中猪肺炎支原体感染诊断药盒的基础，例如，根据抗体检出本发明表面抗原的道理，可用诊断药盒在猪群中，每10或20个猪中抽取一个，常规地、经常地检查支原体感染是否存在。检查阳性，应对整个猪群用本发明的抗原尽早接种，以防止支原体的扩散。
本发明还关系于一些多肽和肽链，这些多肽和肽链是猪肺炎支原体细菌表面蛋白的一部分，当施用于猪时它们可刺激生成与猪肺炎支原体结合的抗体。
优选出的多肽选自NNNNEKKK;NNPESKSQDNANKGNYLSLNIGYRSFADKPDLLMVMMQSQKLYKNLVNRQLWLILSHKKQVKKECIENGQKIAKDLGE;
NSKMSLKNTEPNFFYGIYEKAIDKRFSLIDKIKI;
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上述氨基酸编码中，字母符号所代表的氨基酸如下F苯丙氨酸 L亮氨酸I异亮氨酸 M蛋氨酸V缬氨酸 S丝氨酸P脯氨酸 T苏氨酸A丙氨酸 Y酪氨酸H组氨酸 Q谷氨酰胺
N天冬酰胺 K赖氨酸D天冬氨酸 E谷氨酸C半胱氨酸 W色氨酸R精氨酸 G甘氨酸本发明还关系到重组DNA分子，用其制备上述肽链。以DNA顺序为特征的优选的重组DNA分子选自GAACAACAACAATGAAAAAAAAGAAATAATGCGTGATTTTTTTGAAAAGGGAAGAAAAGGCCTTTTTTTATTACCAGTTATATGGCCCTCTTTTC;
AAATAATCCTGAATCAAAATCGCAAGCTAATGCAAATAAAGGAAATTATCTTTCTTTAAATATTGGTTATCGTAGTTTTGCTGATAAACCTGACTTGCTGATGGTTTTATTACAGTCCCAAAAGTTGGTAAAGAACTTAGTAAATCEACAATTATGGCTGATCCTGTCCCATAAAAAACAGGTAAAAAAAGAGGACATCGAAAACGGGCAAAAAATAGCAAAAGACCTTGGTGAA;
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与上述任何一个DNA顺序杂交并表达猪肺炎支原体表面抗原编码的DNA顺序;猪肺炎支原体表面抗原的DNA编码顺序是用前述任何一个DNA编码顺序所表达;DNA顺序退化造成前述DNA顺序的基因编码和猪肺炎支原体表面抗原的编码。
图1叙述重组DNA分子PME1921的转译的DNA顺序的有关部分。该图还用单一字母的氨基酸编码，表示融合蛋白的氨基酸顺序的有关部分，此融合蛋白由PME1921表达产生的。DNA顺序和氨基酸顺序的划线部分示为专一地来自猪肺炎支原体的部分。图1中剩余的DNA和氨基酸顺序则示为来自用于克隆支原体序列的表达载体和连接子的顺序，图1还表示在这里使用的单一字母氨基酸编码。
图2表示重组DNA分子PME1922转译的DNA顺序的有关部分。该图还叙述用相关的DNA顺序编码表达的氨基酸顺序。再之，划线部分用以表明是来自猪肺炎支原体的DNA和氨基酸顺序的部分。剩余的DNA和氨基酸顺序则是来自表达载体和连接子。
图3表示重组DNA分子PME1925转译的DNA顺序的有关部分。该图还表示用相关的DNA顺序编码表达的氨基酸顺序。再之，划线部分用以表明是来自猪肺炎支原体的DNA和氨基酸顺序的部分。剩余的顺序的部分则是来自表达载体和连接子。
图4表示重组DNA分子PME2413的转译的DNA顺序的有关部分。该图还叙述用相关的DNA顺序编码表达的氨基酸顺序。再之，划线部分用以表明是来自猪肺炎支原体的DNA和氨基酸顺序的部分。剩余的顺序部分则是来自表达载体和连接子。
图5表示重组DNA分子PME442转译的DNA顺序的有关部分。该图还叙述用相关的DNA顺序编码表达的氨基酸顺序。再之，划线部分用以表明是来自猪肺炎支原体的DNA和氨基酸顺序的部分。剩余的顺序的部分则是来自表达载体和连接子。
图6说明猪抗血清19和20的特异性。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出支原体蛋白后，转移至硝酸纤维素滤纸并经下述血清处理抗血清19(第2行)，抗血清20(第4行)，抗血清19(第1行)和20(第3行)的予先免疫血清。上述这些与含有标以[125I]、完整的支原体的蛋白凝胶进行放射自显影比较(第5行);与培养条件下，标以[125I]的超声粉碎处理的支原体提取物相比较(第6行);并与活体内，标以[35S]-蛋氨酸的完整支原体蛋白，相比较(第7行)。第8行示完整支原体蛋白的马斯兰染色。用分子量标准物(Sigma厂出品)测得之分子量(10)示于右侧。
图7叙述用于创建本发明优选基因库的表达载体p EX29。该载体是表达载体p PIC24.的衍生物。该图指明在PL启动子和MS2区(编码100N-端氨基酸)之间，原始的EcoR1的位点缺失;并指明多聚连接子置于BamHⅠ和HindⅢ的位点上。该图还指明复制的起始点(Ori)和β-内酰胺酶(Amp)的编码的区段。
图8说明表达于大肠杆菌E.内融合蛋白的特异性。(A)由基因库免疫筛选出10个克隆的细胞提取物，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并以考马斯兰染色，p PIc24自身是一个11千道尔顿的蛋白质，相当于MS2聚合酶的N-端(最右侧)。(B)用上述聚丙烯酰胺凝胶电泳将全部细胞提取液级分离后，将分离出的蛋白转移至硝酸纤维素滤纸过滤并与抗血清19一起孵育。结合的抗体用[125I]标的蛋白质A检测并进行放射自显影。可见融合蛋白与抗血清呈不同强度的反应，这显然取决于融合蛋白合成的数量。[14C]标记的分子量标准物(NEN Corp.)示于左侧。
图9表示猪肺炎支原体蛋白与特异性抗血清的免疫吸附图。如图1所述制成硝酸纤维素条带，经各种不同的抗血清处理。用抗血清19染出的支原体轮廓作为参考带。用抗血清检出本发明的各表面抗原体来识别支原体蛋白，以箭头表示之;它们的近似分子量是根据与分子量标准物比较而得，在图中示于右侧。(分子量标准物在左侧)。
图10表示本发明克隆的表面抗原对胰酶的敏感性。完整的支原体细胞(相当培养液1ml)在有胰酶(50μg/ml)或没有胰酶的条件下孵育后，用聚丙烯酰胺电泳的方法将蛋白分离，用考马斯兰染色或转移至硝酸纤维素滤纸以供免疫吸附分析。如图所示吸附是将其与抗血清孵育，而抗血清是由抗我们克隆的各种抗原而获得。图中箭头指示被抗血清所识别的蛋白质的位置。
如上所描述的，本发明的特点是猪肺炎支原体的表面抗原。尤其是本发明有关的表面抗原可使处理过的猪免疫，不受感染，或是用于这种感染的诊断方面。
本发明的表面抗原包括一些多肽和肽链，该多肽和肽链显示固有的猪肺炎支原体表面抗原的抗原性。因此本发明表面抗原即是DNA编码顺序转化的宿主生成的重组多肽。当然应该明白这些多肽可能含有与猪肺炎支原体无关的残基。例如，本发明的重组多肽可能成为融合蛋白，包含有来自表达载体或其它来源的蛋白部分，并包含有来自猪肺炎支原体的蛋白部分。该重组多肽及其融合物还可能包括一个起端的蛋氨酸。所有这些使最终的多肽显示如上所述的固有的猪肺炎支原体表面抗原的抗原性。
在本发明的表面抗原中还有合成或重组上述多肽的肽链。该肽链的特点是具有一个或几个由表面抗原鉴定的表面抗原位点。这些位点可以测定，含此位点的肽链也可用不同的方法制成。例如，见欧洲专利申请83301589.4，公布号为0090581，发表于1983年10月5日。和Geysen，H.M.，etal.所著“Use of Peptide Synthesis To Probe Viral Antigens For Epitomes To A Resolution of A Single Amino Acid”，Proc.Nate.Acad.Sci USA，vol 81∶3998-4002，1984。在此提出这些材料以结合参考。
本发明的表面抗原还包括上述肽链或多肽的突变。此突变发生在DN或氨基酸的水平，可用以改进抗原的产量、抗原的免疫原性或抗原性、或改进它们的对各种纯化方案的相容性及对各种佐剂和各种给药方式的相容性。
最后，本发明的表面抗原可与同种化合物抗原性位点或混合化合物抗原性位点相连接。当然，此连接，可见于按照本发明，来自上述的各类表面抗原中。
参考图1至图5。在本发明限定的纲目内，描述了其中各种表面抗原。例如，各图显示一融合蛋白，此融合蛋白由来自表达载体及其连接子的蛋白部分和来自猪肺炎支原体的蛋白部分所组成。但每一融合蛋白都显示本发明表面抗原所要求的抗原性。应该明了，仅只融合产物的猪肺炎支原体部分也可显示其抗原的特点，并且也是在本发明的范围之内。因此，该多肽的已知重组或合成的技术也是本
发明内容
的一部分。相似的肽链，在抗原位点的基础上，以上述多肽的操作办法同样可制备出来，并且也没有脱离本发明的范围。最后，图1至图5中表示的支原体DNA顺序(划线部分)，按照本发明可用作杂交探针，选择猪肺炎支原体的其它的表面抗原;和选出完全或至少是较为完全的抗原的DNA编码顺序，DNA顺序编码的该抗原其氨基酸顺序也是图中显示的一部分。然后，将该DNA顺序以图1至图5中，对DNA顺序实质上相同的方法去制备本发明的表面抗原。图1至5中显示的各个DNA顺序，这些顺序的划线部分和由此而选出的DNA顺序，都包括在本发明范围之内。
在猪肺炎支原体表面抗原DNA顺序编码的克隆和表达中，有很多种载体可供使用。例如包括有染色体片段组成的载体，非染色体的和合成的DNA顺序，诸如各种已知的SV40的衍生物，已知的细菌性质粒，如大肠杆菌质粒，包括ColEl，p CR1，p BR322，p MB9及它们的衍生物;广泛的宿主质粒，如RP4，DNAS噬菌体，如λ噬菌体的众多衍生物，如NM989，和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单带DNA噬菌体;酵母质粒，诸如，2μ质粒或其衍生物;还有来自DNAS噬菌体和质粒结合的载体，诸如，供DNA噬菌体或其它表达控制顺序使用的修饰的质粒。
在各专一性的克隆或表达载体中，有很多位点可供本发明插入的DNA顺序选择使用。这些位点通常是用限制性内切酶点命名，用这方面的技术该酶可识别位点并切割之。众所周知，在位点间插入DNA顺序形成重组DNA分子，有很多种方法。例如，包括dG-dC或dA-dT尾接法，直接连接法，合成的连接子外切酶和聚合酶-连接修复反应后，继以连接的方法，或用DNA聚合酶将DNA带延伸为适宜的单链模板后，继而连接的方法。当然，应该明了本发明所用克隆或表达载体并不需要限制性内切酶的位点供选定的DNA片段插入，而是采用其它的方法使载体与片段结合。
为了表达本发明的DNA顺序，这些DNA顺序有效地连结到一个或更多个表达控制顺序中。这一有效连结可在选定DNA顺序插入克隆载体之前或以后实施，使表达控制顺序能够控制或启动插入DNA顺序的表达。
广泛多样表达控制顺序中的任何一种顺序一控制DNA顺序表达的顺序，当对其施以有效连结时一可用于载体中以表达本发明的DNA顺序。象这样可用的表达控制顺序，包括例如，SV40的早期和晚期的启动子，Lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，λ噬菌体的大操纵子区和启动子区，fd外衣蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激活酶的启动子，或其它糖解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，如Pho5，酵母α-matung因子的启动子以及其它原核细胞或真核细胞及其病毒基因的控制表达的顺序和由此而结合的各种顺序。在哺乳动物的细胞中，将基因连结到去氢叶酸还原酶编码中并选用中国仑鼠卵巢细胞为宿主，可为扩增表达单位增加了可能。
载体或表达载体、尤其是为选定的DNA片段插入选定的位点和本发明使用的表达控制顺序，是由各种各样很多因素决定的，如，对某一特定的限制性酶敏感位点的数目，被表达的蛋白质的大小，表达的特征，诸如与载体有关的顺序编码的起始和终止的部位，以及其它一些已知的技术工作中的因素。选择载体，表达控制顺序和选择为特定的磷脂酶抑制蛋白顺序插入的位点，是由这些因素综合平衡而决定的，对一种情况来说，不是所有选择都能完全地有效。
本发明的优选实施例中，我们使用一个来自细菌噬菌体λ(PL)的衍生物，细菌性质粒p EX29，作为表达控制顺序。p EX29是p BR322的衍生物，并在EcoRⅠ的位点将我们的DNA顺序插入质粒中进行无性繁殖和表达。
重组含有所需基因的DNA分子，将其有效地连结于表达控制顺序上，然后转化多种宿主中适宜的宿主，使转化宿主能表达该基因或由此而得的片段，产生杂交DNA编码的多肽或它的一部分。重组DNA分子同样可用于转化宿主使宿主能复制产生更多的重组DNA分子，以作为猪肺炎支原体基因及其片段的来源。
在制备本发明的抗原和DNA顺序中，有很多种宿主可以使用。这些宿主包括例如，细菌，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属;真菌，诸如酵母;动物，诸如CHO细胞和组织培养中的植物细胞。
由这些宿主中选择一个适宜的宿主使用时，受技术操作中已知的许多因素的控制。包括例如，与选定载体的相容性，付产物的毒性，所需多肽回收的易行性，表达的特征，生物完全性和成本。为一特定的重组DNA分子或多肽，由这些因素中任何一种因素绝对地选择宿主是不行的，而应综合平衡这些因素，因为真实情况是全部的宿主都不能完全有效的表达一个特定的重组DNA分子。本发明的优选整体方案中，我们使用了大肠杆菌GCl，该菌包含pc1857质粒，具有耐卡那霉素和对λCI温度敏感抑制的基因编码。
如前所证实，应该明了一个克隆或表达载体在选定位点插入的DNA顺序，可包括不是所需多肽真正基因编码部分的核苷酸，或者仅只包括该蛋白整个基因一个片段，仅仅要求的是不管使用什么样的DNA顺序，转化宿主应产生本发明的多肽。例如，本发明的DNA顺序可在本发明表达载体中，以同样读码融合而成为至少是一个真核或原核传递体蛋白编码的DNA顺序一部分，或至少是一个真核或原核信号顺序或它们的结合顺序的DNA顺序编码。这样的结构有助于所需DNA顺序的表达，改善纯化，有利于突变，还有助于由宿主细胞得到所需的多肽。DNA顺序可包括一个ATG起始编码，单独的或与其它编码一起，二者替换着，直接融合到为所需多肽第一个氨基酸编码的顺序。这样的结构能产生，例如蛋氨酰或其它肽基的多肽，该多肽为本发明的一部分。这个N-端的蛋氨酸或肽链，可用各种已知的方法，在胞内或胞外切割，或者以本发明的方法，该多肽与蛋氨酸或其它附着的融合蛋白组合。
本发明的多肽和肽链显示的猪肺炎支原体的抗原性可用于建立鉴定猪群中支原体肺炎感染的方法和药盒，并且由此而识别某一猪群中已被该病毒感染的猪，以便尽早给猪群接种而抵抗感染。
为了上述目的，例如，以本发明的重组DNA分子转化宿主制成的表面抗原或抗该抗原而得的抗体，可用放射免疫法或酶联免疫吸附法测定之。放射免疫测定的方法之一抗本发明表面抗原的抗体，在实验室动物，如兔体内获得，将其附于固相载体上，例如，置于试管内。然后向试管内加入表面抗原使之与抗体结合。每一猪群内，每10至20个猪中任取一个猪血清样品，与一已知量的标以放射性同位素，诸如放射性碘的表面抗原的抗体混在一起后，加入覆以抗原抗体复合物的试管内。在猪血清中任何表面抗原(猪肺炎支原体感染的一个标志)的抗体将与标记抗体竞争抗原一抗体复合物上没有结合的位点。一旦血清完成了相互作用，则将多余的液体除掉，冲洗试管后，计数放射性活性的数量。阳性结果，即检查的猪血清含有猪肺炎支原体抗体，表现为放射活性的计数降低。
酶联免疫吸附测定的方法之一微孔平板覆以本发明的表面抗原，每一猪群内，每10至20个猪中任取一个猪血清样品，加在微孔平板上。孵育一段时间，使血清中存在的抗体与抗原相互作用后，冲洗平板，并加入由实验动物制备取得的，连以酶标记的表面抗原的抗体，孵育使其发生反应后，再次冲洗平板。此后，在微孔平板上加入酶的底物，孵育一段时间，使酶作用于底物，并对最后制品的吸附进行测量。吸附变化大表明为阳性结果，即检查的猪血清中含有猪肺炎支原体的抗体，而猪是被该病毒所感染。
用已知标准方法的技术可制备本发明供猪使用的疫苗。例如，选定的多肽可溶于消毒的生理盐水溶液中。为了长期储存，可将多肽冷冻干燥，给药之前，再制成消毒生理盐水溶液。冷冻干燥前可加入防腐剂和其它诸如甘油或氯化钠等保证其容量的标准添加剂。一个适宜的佐剂也可与疫苗一起给药。
根据本发明，疫苗也能够用，在实验动物如兔体内获得的抗本发明多肽的抗体而制成。此“被动”免疫疫苗给猪应用时，能够保护猪免受肺炎支原体的感染。
本发明疫苗优选的是溶在消毒生理盐水中，注射给药，剂量为每个猪几毫克的多肽。疫苗的优选给药时间是猪龄1至2周，并且最好是在猪龄4-6周时，追加再次免疫或强化注射一次。
实施例1.猪肺炎支原体的培养我们从美国样板培养中心得到猪肺炎支原体(贮藏号ATCC27719)，将其培养在37℃的Friis氏培养基(见N.F.Friis，Nord.Vet.Med.27期，337-339页(1975年)。将原种培养物贮存在-70℃以1∶10稀释接种在培养液上。在对数中期(2-5×107细胞/毫升)收集支原体，这时培养液颜色变成淡澄黄色。将培养物在4℃，12500×g下离心15分钟。在PBS缓冲液中洗两次(含150mM氯化钠，10mM磷酸钠的缓冲液pH7.4)，重悬在原体积1/100的PBS缓冲液中。
2.标记支原体蛋白根据J.J.Marcha louis等人的方法(见Biochem，J.124期921-927页(1971年)，将猪肺炎支原体表面蛋白在乳过氧物酶催化下碘化。取20ml对数中期培养物，在PBS中洗两次，悬在0.6ml的PBS中。将0.3ml的悬液用超声波予处理(5×15s)，用作对照。将全部细胞和超声处理细胞标记，加入的试剂(溶在PBS中)量和顺序如下5μl(5×10-5M，Merck公司产品，10μl乳过氧物酶(0.2mg/ml，Sigma公司产品)，50μci游离125I载体(New Enland Nuclear公司产品)和3μl H2O2(9×10-4M)。5分钟后，加入3μl的H2O2，反应持续5分多钟。将样品缓冲液加入放射性碘化的样品，然后跑凝胶电泳。
将20毫升Friis培养液中的培养物用250μci〔32S〕-蛋氨酸(Amersham公司产品)标记总体支原体蛋白。在对数中期收集细胞，如前制备蛋白萃取物。
3.分离DNA用Blin和stafford方法(“核酸研究”3期，2303～2308页(1976)年))从猪肺炎支原体培养物中分离其基团组DNA，用其分离真核细胞的DNA。
4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western吸附法用Laemmli方法(见“自然”227期，680-685页(1970年))，将大肠杆菌萃取液或支原体溶胞液在聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳。再用Towbin等人(见美国国家科学院学报，76期，4350-4354页(1979年))方法进行Western吸附。从而将电泳分离的蛋白电泳转移到硝酸纤维纸上(4℃下以60伏/0.3安培，在192mM甘氨酸，25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)和20%甲醇中用Transblot电泳装置(Biorad公司产品)，电泳转移一夜，再用抗血清和放射碘化的蛋白A鉴定分离的蛋白。
5.制备抗血清将新鲜猪肺炎支原体培养物直肠注入一头未被支原体感染的10周令猪(每次注射2×107个细胞)，在3个月内每隔2到4周注射一次。每次注射前一周采集血清，第六次注射后取的抗血清(抗血清19)用来进行下述的免疫筛选。将第二头10周令猪以用Freund氏完全佐剂乳化的2×107支原体直肠接种一次，3周后采集抗血清(抗血清20)也用来进行免疫筛选。
我们用Western吸附法分析这些支原体表面抗原抗血清的特异性。首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析总体支原体蛋白，将分离的蛋白转移到硝酸纤维素滤纸上，用抗血清19和20以及对这二者予先免疫的抗血清处理滤纸。结果示在图6(举1为予免疫血清对抗血清;带2为抗血清19;带3为予先免疫血清对抗血清20;带4为抗血清20;带8为用考马斯兰染色的总体支原体蛋白质)。如图6所示，我们的抗血清只识别了总体支原体蛋白中限定的一组大约11个蛋白。
为说明这些抗血清特异识别的支原体蛋白都位于细胞表面。我们可将总体支原体蛋白的Western吸印图与用乳过氧物酶法碘化总体支原体的〔125I〕-标记蛋白的放射自显影图比较，因为仅仅细胞表面蛋白才被碘化(图6，带5)。如图6带5所示，许多在Western吸印中与两种抗血清反应的蛋白也都与在整个菌中被碘化的蛋白共迁移。这说明我们的抗血清对细胞表面蛋白是特异性的。
我们也将整个支原体碘化与体内用〔35S-蛋氨酸〕标记的超声处理细胞萃取液(图6，带6)或总体支原体蛋白(图6，带7)比较。与仅有少数蛋白标记(大约10个)的整个细胞标记相反，该细胞萃取物碘化和总体细胞蛋白标记导致多得多的蛋白被标记，它的轮廓与用考马斯兰染色的总体染色的总体支原体蛋白相似(图6，带8)。结论是我们的抗血清主要是抗细胞表面组分的，首先结合在支原体膜外面。
5.克隆支原体DNA片段我们决定将支原体DNA直接克隆到一个表达载体中，用上面制备的抗体筛选表达支原体表面抗原的表达载体文库。
在200μl含33mM Tris-HCl(pH7.6)，10mM Mn Cl2，1mMβ巯基乙醇的缓冲液中，室温下用2ng脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Boehringer，Mannheim公司产品)酶解20μg支原体基因组DNA(上面制备)5分钟，得到大约100～1000对碱基对的片段(平均约300对碱基)。加入大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，〔32P〕-标记的EcoRⅠ酶切支原体DNA，将其连接到表达载体PE×29的EcoRⅠ位点。
表达载体PEX29(E.Beck建立，未发表)是pPLc24的衍生体(见E.Remaut等人“基因”15期，81～93页(1981)及它们在“基因”22期，103～113页(1983)的文章)。如图6所示，与pPLc24比较PEX29P在缺失的PL和Ms区(为100个N-末端氨基酸)之间有EcoRⅠ原来的点和一个引入BamHⅠ和HindⅢ点间的一个多连接子。与pPLc24一样，其表达载体携带为β-内酰胺酶编码的基因(抗氨苄青酶素)。
1 PMO1 DNA(从所加连接子放射活性推算)连接到1PMO1载体，生成大约5×104个转化体;大约75%携带插入体的克隆。
将大肠杆菌GCl菌株(T.F.Meyer送的礼品见T.F.Meyer，“细胞”30期，45～52页(1982))在28℃培养，达密度为4～7×107细胞/毫升。根据D.Hanahan的方法(见“分子生物学杂志”，166期557～580页，1983)，用其制备转化体。质粒pcI857转化的菌株被用作制备携带支原体DNA插入体的PEX29的克隆和表达宿主。质粒pcI857携带一个卡那霉素抗性标记和温度敏感的λCⅠ抑制基因(见E.Remant等人“基团”22期，103～113页(1983年))，它从pL启动子调节表达。菌株有该质粒存在时，将其在42℃孵育于培养液中诱导，表达载体中支原体的DNA可以表达。通过核糖体结合点从Ms聚合酶起始在PEX29中的转译。(见图6)。在PEX29的EcoRⅠ点，插入DNA的表达产生一个由Ms2100个N-末端氨基酸，连接子编码的任意氨基酸和在任意相中止码前，及插入DNA中无中止码时，DNA插入体编码的氨基酸及为紧跟着连接子和产生第一个相内中止码的载体顺序编码的任何附加氨基酸组成。
6.基因组文库的免疫筛选大约3×105个转化体于28℃，生长在20个25cm×25cm琼脂平皿上，生成直径为1mm的菌落。将这些菌落转移到硝酸纤维滤纸上。转移后立即将滤纸铺在预热的琼脂平皿上，20℃下搁置2小时。将菌落暴露在氯仿蒸汽中15分钟，使菌落溶胞。然后将滤纸风干30分钟，浸泡在含2%牛血清蛋白的PBS中2小时，与抗血清19(用含1%牛血清蛋白，0.01%NP40的PBS将其稀释500倍)孵育过液。孵育前，用E.Coli萃取液吸收抗血清，降低菌落染色的本底。用含0.05%NP40的PBS洗滤纸，用〔125I〕标记的蛋白A孵育4小时，用PBS，0.05%NP40大范围地冲洗滤纸。重复取出放射自显影图上显示信号的菌落，用同样程序再筛选。
大约有40个克隆显示不同程度的正信号。最后选出其中10个用来分析它们表达的蛋白，数量占合成总蛋白的10到20%。其余的克隆或者是只提供少量(＜10%)合成的融合蛋白或者是提供不稳定的融合蛋白质。因此就没进一步定性它们。当然必须懂得其余选择的克隆含为支原体细胞表面抗原编码的DNA顺序。所以，它们和其它用本发明方法选择的克隆也是本发明的一部分。为分析其顺序，与上述选出的10个克隆一样来处理这些克隆。也可将其顺序与选出的10个克隆的顺序比较，并用在各种表达载体中生产由它们编码的抗原。
7.大肠杆菌中融合蛋白的表达将所选10个克隆于28℃培养在每毫升含50μg氨苄青霉素和25μg卡那霉素的LB培养基中，直到密度为2×108细胞/ml。在有效通气条件下将培养物(用预热的培养基稀释5倍)在42℃孵育2小时诱导表达。(见H.Kiipper发表在第四届国际工业微生物遗传会议刊222-226页(1982)的文章)。然后将0.5ml细菌样品(相应有2×108个细胞)沉淀，再悬浮在相同体积的样品缓冲液(含4%SDS，125mM Tris-HCl pH6.8，10%β-巯基乙醇，10%甘油和0.02%溴酚兰)中，煮沸5分钟，在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析(见英国LaemmLi，“自然”227期，680-685页(1370))。
图8(A)表示选中的10个大肠杆菌克隆总体细胞萃取液的考马斯兰染色凝胶。该图也显示纯化的质粒pPIc24用考马斯兰染色的萃取液，该质粒表达相应于Ms2聚合酶N-末端的11K蛋白，图8(B)表示上述用抗血清19和〔125I〕标记的蛋白A吸附的所选细胞萃取液的Western吸附图。正如图8(B)所示，用不同强度的抗血清与融合蛋白反应的结果。为大量制备这些蛋白。将在28℃培养一夜的20ml培养液在180ml培养基中稀释，于42℃搅动孵育2小时，将细胞沉淀，然后用30ml含50mM Tris-HCl(pH8)，100mM Na Cl缓冲液冲洗细胞，再重悬在1.6ml含10%蔗糖，50mM Tris-HCl(pH8)缓冲液中。加入0.4ml溶胞酶(5mg/ml)和0.4ml0.5M EDTA，将细胞在37℃孵育30分钟。然后加入4ml去利通溶胞混液(含0.1%去利通X-100，50mM Tris-HCl pH8.0，72.5mM EDTA)，将混液搁置冰上15分钟，进一步在37℃孵育30分钟。然后将细胞超声波处理(4×15s)，再在20，000×g下离心30分钟，然后离心，再用5ml 7M尿素37℃下萃取30分钟。用12.5%制备性SDS-聚丙烯酰胺纯化溶在7M尿素上清液的融合蛋白。
用考马斯兰(含0.06%考马斯亮兰，50%甲醇和10%醋酸)染色10分钟，冲洗后肉眼可见融合蛋白带。将凝胶捣碎，用含0.1%SDS的PBS于42℃将蛋白洗脱。离心将蛋白与聚丙烯酰胺分离，再将含融合蛋白的上清液浓缩到1mg/ml。从20ml培养一夜的培养物平均可得到0.2～1mg蛋白。
8.用在家兔中产生的抗融合蛋白抗血清鉴定特异性支原体蛋白在家兔中生产抗上述的Ms-支原体融合蛋白的抗血清。将200～500μg凝胶纯化蛋白给每只家兔皮下注射，每2-3周注射一次，共注射3次。第一次注射时用Freund氏完全佐剂。以后注射都用Freund氏不完全佐剂。3个月后，收集抗血清，用Western吸附分析。在ELISA试验得到的不同抗血清的滴度为1∶103到1∶104。
用猪肺炎支原体总体细胞蛋白Wwstern吸附分析抗血清中存在的特异性支原体蛋白的抗体。图9表示四个制备的抗血清的结果主要与分子量为90.000，命名为p90的蛋白反应的抗-1922;主要与分子量为68，000的p68和26，000的p26反应的抗-2413。识别分子量为50，000的p50蛋白抗-442。抗-1921识别分子量为30，000的p30蛋白。抗-1925也与同样分子量的蛋白(因9中未标出)反应。所有这些蛋白都与被抗血清19强染色的支原体带共迁移，它们在图中都用箭头指示出，只有与一个小带相关的p26没指示出。用不同融合蛋白免疫的家兔子先免疫血清不被支原体蛋白染色。(没在图9中示出)。这些结果说明我们分离的支原体抗原诱导了能与不连续的猪肺炎细胞表面抗原反应的特异性抗体。
我们也将支原体表面抗原抗血清识别的支原体表面蛋白与它对胰蛋白酶解敏感，因而可能位于支原体细胞表面联系起来。
作为对照，我们先制备20ml新鲜支原体培养物。然后离心培养物，用PBS洗一次，再将其悬在2ml的PBS中，用50μg胰蛋白酶孵育1ml的该悬液。剩下的1ml作为对照不加胰蛋白酶。室温下孵育10分钟后，将两试管内的细胞离心，用PBS洗一次，将沉淀悬在同样缓冲液中，注入聚丙烯酰胺凝胶。用考马斯兰将分离的蛋白染色，或转到Western吸印用的硝酸纤维纸。结果示在图10。
如图10(CB)所示，一些高分子量蛋白选择性地被胰蛋白酶解成一些小分子量蛋白。图10(WB)还表示了胰蛋白酶解除去了与本发明表面抗原抗血清特异性识别的表面蛋白p90，p68和p50相关的抗原。同时，这些抗血清识别的蛋白位于细胞表面并具有很多暴露在外面对胰蛋白酶敏感的部位。两个其它的蛋白，抗-1925(图10)和抗-1921(没表示)识别的p30和抗-2413识别的p26对胰蛋白酶不敏感。p30和p26蛋白对胰蛋白酶这种不敏感性并不意味着它们是非表面蛋白，因为一些表面蛋白也可以结合到细胞膜中，从而它们没有胰蛋白酶解所需的位点。p30也不与碘化的表面蛋白共迁移。进而，这也不能清楚地证实p30就不是一种表面蛋白，因为p30可能代表一种小的表面成分或一种缺乏酪氨酸残基的蛋白，因此它不能很好的被标记。
抗-1921和抗-1925都识别p30。Southern吸印显示插入到PME1021和1925的DNA属于不同的限制片段。因为两个克隆的DNA顺序没有同质序列部分，所以两个克隆可能对应同一个基因的不同区域或两个为同样分子量的蛋白编码的不同基因。
另一方面，p25与一个碘化蛋白共同跑电泳，并被抗血清19微弱地识别。因此，它好象是位于细胞表面上。p26也是被抗-2413识别的两个蛋白之一，另一个蛋白是p68。这些蛋白或者可能是两个具有共同抗原决定簇的无关蛋白，或者p68是p26的前体。第二种可能性为Southern吸印分析所支持，分析结果表明仅一个基因组片段与PME2413克原体插入部分杂交。
我们克隆的抗原定位在表面最直接的证据是将支原体与特异性抗体原位标记。
冷冻薄切片和抗体标记是根据G.Griffiths等人(见“酶学方法”96期，466-485页(1983年))的方法进行的。将从10ml培养物得到的支原体细胞沉淀固定在4%的甲醛中，用2.3M蔗糖浸渍，再冷冻在液氮中。用玻璃刀切片，将薄切片化开，转移到Formvar/涂碳的，100目的铜栅上，浮在10μl Ig G悬液上(用含1%小牛胎儿血清的PBS稀释10倍的)，在室温下孵育30分钟。30分钟内用PBS冲洗五次铜栅，然后转移到5μl微量的金黄蛋白A溶液中(1mg/ml)，用含10%小牛胎儿血清的PBS稀释30倍。室温下使其反应20分钟。用PBS在30分钟内，将铜栅再冲洗5次，再用蒸馏水冲洗4次。然后用2%醋酸双氧铀染色，然后包埋在1.5%甲基纤维素溶液中。电镜下观察切片。微电镜图说明抗血清19结合在支原体膜上，而抗-1922结合的较少。
9.为支原体细胞表面抗原定性为了进一步为本发明的细胞表面抗原定性，我们用常规的DNA序列测定方法测定了五个克隆的顺序(PME1921，1922，1925，2413和442)。得到的DNA顺序及从它衍算出的氨基酸顺序分别示在图1到图5，每个图都显示从表达载体和连接子(及由它编码的氨基酸顺序)得来的表达DNA顺序的一部分和从猪肺炎支原体衍算的DNA顺序及它的表达产物。例如图1中，1-32核苷酸(PME1921)是从载体和连接体得来的，而33-125核苷酸是从支原体得来的。然后只表达了八个支原体氨基酸，这是因为其中有一个中止信号(位于57-60核苷酸，见图5)。另一方面，在PME1922中，整个插入的支原体顺序得到了表达，这是由于其中的第一个中止信号在位于该克隆支原体插入顺序的羧基末端的载体顺序中。
我们制备的5个克隆的DNA和氨基酸顺序都可以不同方式用于制备本发明的其它表面抗原。例如特异的支原体编码顺序或它们的片段可从每个克隆分离，并将其用在其它表达载体生产由它们编码的抗原，这些抗原是融合蛋白或仅是支原体衍生蛋白。这些编码顺序或片段也可用作制备DNA探针(人工合成或从克隆本身提取的)，这些探针又用来筛选其它DNA文库(cDNA或其因组DNA)，通过杂交选择出那些为最完整的已为我们制备的克隆编码的抗原编码的同质DNA序列和为其它相关支原体表面抗原编码的DNA序列。例如可以从在一个λgt10或λgt11载体制备的较长的DNA插入体的一个基因组文库中筛选出为这些表面抗原编码的全长基因。然后将这些基因如上述在一系列广泛的宿主和表达载体中表达出由其编码的抗原。
最后，从本发明的DNA序裂衍算出的氨基酸顺序可用于制备含我们细胞表面抗原的一个或几个抗原性部位的合成肽。见欧洲专利申请83301589.4，1983年10月发表的公开号为0090581;和H.M.Geysen等人在美国国家科学院学报81卷3998-4002页(1984)的文章。这些合成肽可用于疫苗及上述的诊断试验。
实施例中所述本发明的DNA顺序，重组DNA分子和转化宿主都贮存在德国Sammlung Von微生物培养收集中心，地址是西德，哥廷根，贮存日为1985年3月19日。样品包括(1)大肠杆菌GCl(PC I857)(PM E1921)，贮藏号D SM3271，(2)大肠杆菌GC1(PC I857)(PM E1922)，贮藏号D SM3272，(3)大肠杆菌GC1(PC I857)(PM E1925)，贮藏号D SM3273，(4)大肠杆菌GC1(PC I857)(PM E2413)，贮藏号D SM3274，(5)大肠杆菌GC1(PC I857)(PM E442)，贮藏号D SM3275，以上叙述了本发明的实施例，很显然，只要根据本发明的材料与方法，可以作适当修改而实施。然而本发明范围是由下述权利要求
来限定的，而不受实施例的限制。
权利要求
1.制备多肽的方法，该多肽可在猪体内诱发与猪肺炎支原体结合的抗体，该方法包括培养用含有选自下列一组之一的DNA序列的重组DNA分子转化的宿主，[a]DNA序列GAACAACAATGAAAAAAAGAAATAATGCGTGATTTTTTTGAAAGGGAAGAAAGGCCTTTTTTTATTACCAGTTATATGGCCCTCTTTTC；AAATAATCCTGAATCAAAATCGCAAGATAATGCAAATAAAGGAAATTATCTTTCTTTAAATATTGGTTATCGTAGTTTTGCTGATAAACCTGACTTGCTGATGGTTTTATTACAGTCCCAAAAGTTGGTAAAGAACTTAGTAAATCGACAATTATGGCTGATCCTGTCCCATAAAAAACAGGTAAAAAAAGAGGTCATCGAAAACGGGCAAAAAATAGCAAAAGACCTTGGTGAA；GAATTCAAAGATGAGTTTAAAAAATACTGAACCTAATTTTTTTGTCGGCATCTATGAAAAGGCAATTGATAAACGTTTTTCTTTGATAGATAAAATTAAAATCG；GAATTCGACCGTAAGTGAAACACGTGATTTTATTCAAAAATTTGACATTTTCTATCAGGAAAATGGGCAAAATCAAAGAAGATTTAGATTTTGCAATAGCTCCAAGTTTTATATCTTTATCACTAATTTCTAAGTCCTTGACTAAAAAATTAGAAATTGCTGCTCAAAATCTTAGTCAGTTTGATTCAGGAGCCTTTACTGGGGAAATCAGTGGCAAAATGCTGCAGGATTTAGGGACAAAATATGTAATT；andGAATTCTGGACCTGTATATGGGCCATTTTTACCGGGCGAAGATAAGCGCGAACTCAACCCAATTGTGGCAAAAAGTGCTAATTCAATCACAATTGATCTTAATATTTTATCGATAATAACCAAAACAAAATTATCAGAGAGAGTTGCAGCCTTAAGCAGAGTTGAATTC；[b]与上述DNA序列杂交的DNA序列和为猪肺炎支原体表面抗原编码并表达它的DNA序列。[c]为上述任何DNA序列表达的猪肺支原体表面抗原编码的DNA序列。
2.根据权利要求
1的方法，其中所述多肽是猪肺炎支原体表面抗原。
3.根据权利要求
1或2的方法，其中所述的DNA序列有效地连接到重组DNA分子中的一个表达控制序列。
4.根据权利要求
3所述的方法，其中所述表达控制序列选自下列一组SV40的早期或晚期后动子，Lac系统，TAC系统，TRC系统，trp系统，λ噬菌体的大操纵子和后动子，fd壳蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶的后动子，其它糖酵解酶的启动子，酵母α-配对(α-mating)因子启动子和其它控制原核或真核细胞或它们的病毒基因表达的序列。
5.根据上述权利要求
的任一项所述的方法，其中所述重组DNA分子选自PME 1921，PME 1922，PME1925，PME 2413和PME 442。
6.根据上述权利要求
的任一项所述的方法，其中所述宿主选自大肠杆菌，假单胞杆菌，芽孢杆菌，酵母或其它真菌，小鼠、猪或其它动物或植物宿主和人组织细胞。
7.根据权利要求
6的方法，其中所述的大肠杆菌是大肠杆菌GC1。
8.根据权利要求
1-6中任一项所述方法，其中所述宿主选自大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 1921)，大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 1922)，大肠杆菌GCI(PCI 857)(PME 1925)，大肠杆菌GCI(PCI 857)(PME 2413)，和大肠杆菌GCI(PCI 857)(PME 442)。
9.根据上述权利要求
中任一项的方法，其中所述的多肽选自NNNNEKKK;NNPESKSQDNANKGNYLSLNIGYRSFADKPDLLMVLLQSQKLVKNLVNRQLWLILSHKKQVKKEVIENGQKIAKDLGE;NSKMSLKNTEPNFFVGIYEKAIDKRFSLIDKIKI;NSTVSETRDFIQKFDIFYQENVGKIKEDLDFAIAPSFISLSLISKSLTKKLEIAAQNLSQFDSGAFTGEISGKMLQDLGTKYVI;andNSGPVYGPFLPGEDKRELNPIVAKSANSITIDLNILSIITKTKLSERVAALSRVEF.
10.制备保护猪免受肺炎支原体感染疫苗的方法，包括至少一定量有效地诱发其免疫应答的前述各权项制备的一种多肽及药学上可接受的载体。
11.制备宿主的方法，该宿主能表达一种多肽，将这种多肽用于猪时可诱发形成与猪肺炎支原体结合的抗体，该方法包括用权利要求
1-5中任一项所述重组DNA转化一个潜在的宿主。
12.根据权利要求
11的方法，其中所述宿主选自下列一组大肠杆菌，假单胞杆菌，芽孢杆菌，酵母或其它真菌，小鼠，猪或其它动物或植物宿主及人组织细胞。
13.根据权利要求
12的方法，其中所述的大肠杆菌是大肠杆菌GC1。
14.根据权利要求
13的方法，其中所述宿主选自下列一组大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 1921)，大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 1922)，大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 1925)，大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 2413)，和大肠杆菌GC1(PCI 857)(PME 442)。
专利摘要
猪支原体的表面抗原，这种抗原是用重组DNA的方法制备的，一种基于该抗原制备的疫苗，用该疫苗治疗和预防猪地方性兽病肺炎，基于这种抗原或它的抗体诊断猪感染肺炎支原体，及为抗原编码的DNA序列。
文档编号C12N5/10GK86102858SQ86102858
公开日1987年10月28日 申请日期1986年3月26日
发明者海因茨·E·沙勒, 莫·奎·克林克特 申请人:拜奥根公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan