专利名称：高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(jxa1-r株)实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 (JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) ^filtMM^Bf^^'nin^!^ (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触 性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已 经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速 蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综合征高致病性变异毒株(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖 与呼吸综合征(highly pathogenicPRRS，HP-PRRQ，给我国养猪业造成了极其严重的打击。 HP-PRRS被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定传染病之一，是我国《一、二、三类 动物疫病病种名录》中的一类动物疫病。目前防控本病的主要措施是疫苗免疫接种。而今 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)已在国内得到广泛应用，它以其良好的 免疫保护效力和安全性对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防控起到了重要作用。传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验 (IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合 酶链反应试验(RT-PCR)等，它们在病毒诊断与进出口检验检疫中发挥了重要作用，但各自 在敏感性、特异性或时效性等方面存在不足，且难以将疫苗株(JXAl-R)与野毒株区分从而 达到检测疫苗株(JXAl-R)的目的。目前，高致病性PRRSV变异株的实时荧光定量RT-PCR 等检测方法虽然已经建立，但是仍然无法特异性针对疫苗株(JXAl-R)进行检测。因此，建 立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 (JXA1-R株)的检测方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活 疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可 靠性好，为评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)免疫效果及疫苗生产的 质量监控提供强有力的技术支持。本发明是通过以下技术方案实现的中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供活疫苗及 如下病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(制备用毒株由中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，CGMCC No. 2467)；高致病性猪繁殖与呼吸综合征2006-2010年不同时期野毒株；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、欧洲型猪繁 殖与呼吸综合征病毒，及各自活疫苗；其他猪源病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒 (CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型 (PCV2)。高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)特异性引物和探针设计所述 的特异性引物，指的是长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与高致病性猪繁殖与呼吸综 合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互 补；所述的特异性探针，指的是长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记 FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合 物(minor groovebinder,MGB)分子，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXAI-R株) Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的寡核苷酸引 物对特征如下由序列为TCCACGCATCCTCGGG的上游引物LV-HP-PRRSV-F3和序列为 TGCTCTCGTCAGACTCCCGT 的下游引物 LV-HP-PRRSV-R2 组成；用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的探针序列特征如 下，该探针为 LV-HP-PRRSV-P，其序列为 CCTCGGCTCCCTCCA。本发明还涉及一种用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的 寡核苷酸引物对和探针的组合物。此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。进一步，本发明还涉及试剂盒在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 (JXA1-R株)中的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、 TAMRA、CY3、ROX 或 CY5。一种利用上述寡核苷酸引物对和探针的组合物检测高致病性猪繁殖与呼吸综合 征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR方法，包括(1)针对PRRSV Nsp2基因设计能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 (JXA1-R株)的特异性引物和探针序列；(2)采用 FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX 或 CT5 任意一种荧光素标记高 致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的探针序列；(3)将用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的引物和探针 置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。本发明的显著特点是充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交技术的良好 特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对样本进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 (JXA1-R株)的检测，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检 测效率等优点。
图1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR引物与 探针优化组合筛选；
图2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测特 异性试验扩增曲线；图3高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测敏 感性试验扩增曲线。图中曲线依次代表高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株) 在浓度为TCIDki IO7 5 10°_5时的扩增结果；图4高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测重 复性试验扩增曲线；图5-1不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)半成品实时荧 光RT-PCR扩增曲线；图5-2不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)成品实时荧光 RT-PCR扩增曲线。
具体实施例方式下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第 三版(北京科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。实施例1标准品RNA的构建(1)实验试剂限制性酶I3St I及其缓冲液，DL2000 Marker购自TaKafci公司；pGEM -T Easy连接试剂盒、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs 购自Promega公司； DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；高效大肠杆菌感受态细胞DH5 α购自北京全式金生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。(2)实验仪器TGRANDIENT PCR 仪购自 HYBAID 公司；DYFII12 型电泳仪购自 Bio-Rad 公司；UVP凝胶成像分析系统购自Gene公司jteril GARD 生物安全柜购自BAKER 公司；恒温水浴锅购自pHaramacia公司；恒温培养箱购自Kendro公司。(3)实验步骤①在GenBank上查找高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(GenBank FJ548853. 1)及其他已知PRRSV基因组序列，通过序列比对确定高致病性猪繁殖与呼吸综 合征活疫苗(JXA1-R株)的Nsp2基因的特异性高度保守区。设计包含高致病性猪繁殖与 呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR扩增核苷酸片段的引物，引物序列见表 1。以高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的RNA为模板，进行RT-PCR扩增， RT-PCR扩增体系和扩增条件见表2，将通过扩增得到的含高致病性猪繁殖与呼吸综合征活 疫苗(JXA1-R株)的保守序列的核苷酸片段称为基因LV-HP-PRRSV-Nsp2 ；②将扩增得到的基因LV-HP-PRRSV-Nsp2核苷酸片段纯化回收，连接到pGEM -T fesy载体(10 μ L连接体系3 μ L基因扩增产物，1 μ LpGEM-T fesy载体，1 μ L T4 DNA连接酶，5yLT4 DNA连接缓冲液；4°C过夜)，然后将连接产物转化到DH5a感受态细胞。通过质 粒的纯化和鉴定，得到含有基因LV-HP-PRRSV-Nsp2片段的标准品质粒；
③用I^st I将LV-HP-PRRSV-Nsp2重组质粒酶切线形化，再以线性化片段为模板进 行体外转录(用 Promega RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 试剂盒)， 反应结束后向体外转录产物中加入RQl DNA酶除去残余的DNA分子。经提取和纯化，得到 标准品RNA分子。表1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)标准品的扩增引物序列
权利要求
1.一种能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的实时荧光RT-PCR方 法，其特征包括(1)针对PRRSVNsp2基因设计能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R 株的特异性引物和探针序列；(2)采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA,CY3、ROX或CT5任意一种荧光素标记高致病 性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的探针序列；(3)将用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的引物和探针置于同 一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。
2.根据权利要求1所述的用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的 实时荧光RT-PCR方法，其特征在于所述的特异性引物为由序列为TCCACGCATCCTCGGG的上 游引物 LV-HP-PRRSV-F3 和序列为 TGCTCTCGTCAGACTCCCGT 的下游引物 LV-HP-PRRSV-R2 组 成的引物对。
3.根据权利要求1所述的用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的 实时荧光RT-PCR方法，其特征在于所述的探针序列为CCTCGGCTCCCTCCA。
4.一种用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株的寡核苷酸引物对和 探针的组合物。
5.一种包括权利要求4所述组合物的试剂盒。
6.权利要求5的试剂盒在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株中的用途。
7.权利要求6的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、J0E、 NED、TAMRA、CY3、ROX 或 CY5。
全文摘要
本发明公开了用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测的核苷酸引物、探针序列及方法，以及该方法在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)中的应用。本发明的方法克服了传统检测技术中存在的不足，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的快速检测及疫苗生产的质量监控。
文档编号C12N15/11GK102140527SQ20101060452
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者倪建强, 夏应菊, 曲萍, 王立林, 田克恭, 翟新验, 遇秀玲, 陈西钊 申请人:中国动物疫病预防控制中心