BamHI、NotI、DpnI:购自宝生物(大连)有限公司。
[0054] 3.细菌基因组DNA提取试剂盒、核酸Marker:购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0055] 4.胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒:购自美国Omega公司。
[0056] 5.T4DNA ligase、蛋白Marker、HRP标记羊抗猪IgG二抗：购自Thermo Fisher科技 公司。
[0057] 6.Glutathione-Sepharose 4B、Prescission Protease购于瑞典GE公司。
[0058] 7. BCA蛋白浓度测定试剂盒:购自碧云天生物技术研究所。
[0059] 8.清洁级Balb/c小鼠：购自重庆市中药研究院。
[0060] 9.猪肺炎支原体抗体检测试剂盒:购自美国IDEXX公司。
[0061]实施例lMhpl07蛋白片段的筛选
[0062] 从GenBank(CP002274)获得Mhp 168菌株Mhpl07蛋白的氨基酸序列，LipoPl .0软件 预测Mhpl07蛋白的信号肽序列为SEQ ID N0:3MQANLIGRFIKNKKAILVLASTFAGLILFTTSVG，被 Spl酶切割（附图lhDAS软件预测Mhpl07蛋白的跨膜区为18-35、626-627、745-748位氨基酸 (附图2)。根据文献报道，Mhpl07蛋白C端能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合宿主 呼吸道上皮细胞肝磷脂和纤连蛋白。因此选择mhpl07基因1666bp-3099bp核苷酸作为扩增 片段，同时对部分核苷酸序列进行突变，在扩增时为了保证蛋白顺利表达，在片段之前加 ATG起始密码子。扩增的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0063] SEQ ID NO：2
[0065] 实施例2重组质粒pMDTM19-mhpl07-C的构建 [0066] 1.猪肺炎支原体168株基因组的提取：
[0067]按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
[0068] 2.引物设计合成
[0069]用Primer Premier 5.0软件设计和分析评价，上下游引物5'端分别引入限制性内 切酶BamHI和Notl酶切位点。由上海Invitrogen公司合成，序列如下：
[0070] mhpl07C-F：(SEQ ID NO：4)
[0071 ] 57-GGATCCATGTCTGGTAAGACATACTTACCTAGTTTAACA-3 7(BamH I)mhpl07C-R：(SEQ ID NO：5)
[0072] 57-GCGGCCGCTTAATTTTTAGAATTTTTTGTTATTATAATTT-3 7(Notl)
[0073] 3.目的基因的PCR扩增
[0074] 以Mhp 168菌株基因组DNA为模板，以mhpl07C-F和mhpl07C-R为引物扩增mhpl07-C 基因片段。采用如下的PCR体系和反应条件。
[0075] PCR扩增反应体系
[0077] PCR反应条件：
[0078] 98°C 预变性 5min; 98°C 变性 lmin，50°C退火 lmin，72°C 延伸 lmin40s，30cycles; 72 °C延伸emiruPCR完成后在反应体系中加入0.25yL Ex Taq DNA聚合酶和2yL dNTPs，振荡混 匀简短离心后72°C延伸lOmin。琼脂糖凝胶电泳观察结果(附图3)。
[0079] 4.PCR产物的回收
[0080] 灌制可上样25mL的1.5%琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示条 带迀移至适当位置时停止电泳。
[0081] 通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片 将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重。
[0082] 按照胶回收试剂盒说明书进行PCR产物回收。
[0083] 5 .mhpl07-C连接pMD?19_T载体并转化大肠杆菌DH5a。
[0084] 通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3: 1的原则，设计连接反应体系如下:mhpl07-C 4.5yL，pMD?19-T载体0.5yL，Solution I 5yL。 16°C 连接 lh。
[0085] 参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌DH5a感受态菌。
[0086] 参照《精编分子生物学实验指南》将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态。
[0087] 6.Amp+LB平板筛选转化成功重组菌
[0088] 挑取Amp+LB平板单克隆接种Amp+LB液体培养基，37°C180rpm摇床培养6h。取2mL菌 液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和Notl双酶切鉴定。反应体系：重组质粒 7.5yL，BamHI 0.5pL，NotI 0.5yL，10XK buffer 0.5yL，l%BSA 1μΙ^37°(3水浴lh，琼脂糖 凝胶电泳观察结果(附图4)。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测 序正确的质粒命名为pMD?19-mhpl07-C。
[0089] 实施例3重组质粒pMDTM19-mhpl07-C点突变
[0090] 1.突变引物设计合成
[0091] 为了将mhpl07-c基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA突变为色氨酸密码子 TGG，以pMD?19-mhpl07-C重组质粒为模板，用Primer Premier 5.0软件设计突变引物，由上 海Invitrogen公司合成。突变引物序列：
[0092] mhpl07CT-F：(SEQ ID NO：6)
[0093] 5'-AACTTGATAATTTTTTAGGGTGGACAAAATTAGATACCAATTTAG-3,
[0094] mhpl07CT-R：(SEQ ID NO：7)
[0095] 57-CTAAATTGGTATCTAATTTTGTCCACCCTAAAAAATTATCAAGTT-3 7
[0096] 2.目的基因的突变PCR
[0097] 以pMD?19-mhpl07-C重组质粒为模板，以mhpl07CT-F和mhpl07CT-R为引物进行突 变PCR。采用如下的PCR体系和反应条件。
[0098] PCR扩增反应体系
[0100] 反应条件:98°C预变性5min; 98°C变性lmin 30s，60°C退火lmin30s，72°C延伸4min 30s，20cycles;72°C延伸lOmin。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。该PCR产物为包含突变 后的mhpl07-C基因及pMD?19-T载体的闭环质粒，与pMD?19-mhpl07-C的不同在于mhpl07-C 基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA变为色氨酸密码子TGG。
[0101] 3.Dpn I 消化PCR产物
[0102] 向PCR产物中加入2yL Dpn I和5.8yL 10XT Buffer，37°C水浴3h。胶回收试剂盒 回收经Dpn I消化的产物。
[0103] 4.Dpn I消化PCR产物的转化及阳性重组子的筛选
[0104]参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌XL-lBlue感受态菌。
[0105]将上述经回收PCR产物参照《精编分子生物学实验指南》转化大肠杆菌XL-lBlue感 受态菌。
[0106] 5.Amp+LB平板筛选转化成功重组菌
[0107] 挑取Amp+LB平板单克隆接种Amp+LB液体培养基，37°C180rpm摇床培养6h。取2mL菌 液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和Notl双酶切鉴定。反应体系和反应条件 同实施例2。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序正确的质粒命 名为 pMD?19-mhpl07-CM。
[0108] 实施例4重组质粒pGEX-6P-2-mhpl07-C与重组菌XL-lBlue-Mhpl07-C的构建
[0109] 1 ·重组质粒 pGEX-6P-2-mhpl07-C 的构建
[0110] 重组质粒pMD?19-mhpl07-CM和载体pGEX-6P-2经BamHI和Notl双酶切。反应体系： 重组质粒/载体37.5yL，BamHI 2.5yL，NotI 2.5yL，10XK buffer 2.5yL，l%BSA 5μΙ^37°〇 水浴4h。酶切后的mhp 107-C和pGEX-6P-2经胶回收试剂盒回收。
[0111] 通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3: 1的原则，设计连接反应体系如下:mhp 107-C 3yL，pGEX-6P-2