专利名称：用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法
技术领域：
发明属于有机化合物的生物合成技术领域，具体涉及ー种用来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的ガ-葡萄糖苷酶程序升温催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法。
背景技术：
甜菊苷(13-[(2-0-ガ-D-Glucopyranosyl-ガ-D-glucopyranosyl) oxy]kaur-16-en_18 -oic acid β -D-glucopyranosyl ester, stevioside,以 F丨荀祢 Stノ 是从甜叶菊{Stevia rebaudiana Bertoni)中提取出的四环ニ職类化合物,是ー种具有后苦潘味的甜味剂。St分子中含有三种糖苷键，经水解可以得到甜菊醇、异甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、悬钩子苷或者其混合物；水解产物的各组分含量取决于水解条件例如用无机 碱催化水解St得到甜菊双糖苷(SharipovaR, et al, 2009),用无机酸催化水解St则得到甜菊醇和异甜菊醇的混合物(专利号200910025817. 3)。例如张大永等通过化学法两步制备甜菊醇，首先St经高碘酸钠或四醋酸铅氧化，然后经碱水解、柱层析纯化后得到甜菊醇(专利号200810242967. 5)。Avent等指出酸性水解St除得到甜菊醇和异甜菊醇以夕卜，还有其他两种同分异构体(Avent A G, et al, 1990)。用同种酶催化水解St也可能得到不同产物。因而如果通过利用酶的高区域选择性酶催化方法水解St，可以ー步直接获得高品质单一水解产物，同时还可以通过改变水解反应条件调控产品组成，Milagre等指出在pH 4. O下，胰酶(Pancreatin)催化St水解反应的产物为异甜菊醇；而在pH 7. O下，产物为甜菊醇(Milagre HMS, et al, 2009)。酶催化虽然优点众多，但热稳定性差成为酶使用过程中不可回避的问题。通常可以通过外加稳定剂，固定化等途径来提高热稳定性。来源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶在75°C下会较快失活，但同时又在70-75 °C下具有最高催化水解效率。因此本发明采用程序升温反应的方式可以有效减少酶的热失活并兼顾水解反应速度，而且避免固定化酶与析出的产物混为一体，减少纯化的困难，提高来源干#廣霉的ガ-葡萄糖苷酶的稳定性并有效缩短完成水解反应的时间。
发明内容
本发明的目的是提供ー种用β -葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法。本发明用筛选出的来源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶，水解St制备得到甜菊醇；通过程序升温反应，降低酶的热失活。生产过程绿色环保，催化效率高，产品分离纯化简单，纯度高。来源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶催化甜菊苷制备甜菊醇的反应方程式如下
权利要求
1.一种用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，其特征是以甜菊苷或者含有甜菊苷的甜叶菊提取物为底物，将其用去离子水或缓冲液配制成150-300 g/L的反应液；55 0C下恒温0. 5 h后加入上述3 -葡萄糖苷酶，同温下反应2-6 h ;然后升温至70-75°C下反应至甜菊苷转化率不再升高；甜菊苷水解成甜菊醇从反应液中析出，而其他甜叶菊提取物的成分没有或很少反应；对反应液进行抽滤，用水洗涤滤渣，再用20%甲醇水溶液重结晶滤渣即可得到甜菊醇产品。
2.根据权利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，其特征是，所说的甜菊苷是指具有如下结构的甜菊苷
3.根据权利要求I所述的用J3-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，其特征是所说的缓冲液为50 mM的pH 4. 0-5. 4的醋酸缓冲液或pH 6. 0磷酸缓冲液。
4.根据权利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，其特征是所说的葡萄糖苷酶来源于黑曲霉，其形态是酶液。
5.根据权利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，其特征是所述葡萄糖苷酶催的添加量为500-1000U/g甜菊苷。
全文摘要
本发明公开一种用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。本发明以来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶为催化剂，程序升温下催化水解从单一甜菊苷或甜叶菊提取物中的甜菊苷来制备甜菊醇，具有转化率高、选择性高、分离简单等优点；通过程序升温反应来降低酶活损失，可提高酶的利用率。本发明提供了一种高效、环境友好的制备甜菊醇的新方法。
文档编号C12P15/00GK102827891SQ20121035246
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者夏咏梅, 方云, 万会达 申请人:江南大学