病毒恢复培养基及其用途和包括该病毒恢复培养基的病毒诊断试剂盒的制作方法

专利名称：病毒恢复培养基及其用途和包括该病毒恢复培养基的病毒诊断试剂盒的制作方法
病毒恢复培养基及其用途和包括该病毒恢复培养基的病毒诊断试剂盒
本发明涉及病毒恢复培养基及其用途和包括该病毒恢复培养基的病 毒诊断试剂盒。更具体地，本发明涉及配有激素和酶的病毒恢复培养基， 所述激素如地塞米^^,所述酶如胰蛋白酶。
用于鉴别病毒的常规诊断过程包括下述步骤将所选的对某种病毒易 感的特定细胞系接种于容器，然后将可能含有病毒的生物样品接种于该细 胞培养物。此类生物样品除了包括其它物质外，还包括唾液、尿、排泄物、 脑脊液(CSF)、呼吸液和诸如来自嘴、鼻腔、咽喉、皮肤和生殖器的化验标 本。随后对接种的细胞培养物进行孵育并考察所述细胞经由病毒诱发的细 胞病变效应。由于某些病毒仅生长于某些细胞，因此可以病毒诱发细胞病 变效应(CPE)或未诱发细胞病变效应的细胞类型为基础对病毒进行鉴别。
对于此过程具有大量备选的实验方案，其包括下述步骤除去已接种 有病毒制品的细胞并使该细胞经受胰蛋白酶作用(trypsinisation)并且通过 对源自病毒的多肽具有特异性的单克隆抗体来检测病毒，所述源自病毒的 多肽使用报道分子，比如荧光素(FITC)分子进行标记。另外的备选方案包 括在培养管内的盖玻片以便促进细胞的恢复。
常规的管(或传统的鼓)法使用了接种有适当细胞系的螺旋盖管(screw cap tubes)。在达到约80%的细胞融合率后，将该管4秦种适当的样品并监控 CPE达三周。第一周须每天监控CPE。第二周和第三周必须减少监控频率。 通常，需要盲传来促进病毒的恢复。
由于需要每天对管进行监控，因此常规管法的一个不利之处在于费时 费力。通常，为了避免主观性，两名人员通过光学显微镜对相同管的CPE 进行检查。此外，并不是所有病毒均能引起可见的CPE,并且不能通过该 方法来检测那些不引起CPE的病毒。而且，在常规的管法中监控到的CPE 信息极大地取决于细胞系的易感性以及病毒产生可见CPE的能力。样品的 毒性还可以不利地产生类似于病毒CPE的变化，从而得出错误的结果。此
外，某些病毒只有在很长的时间周期后才产生CPE(例如细胞巨化病毒 (CMV))。由于通过常规管法获得的结果主要是基于CPE检测并且不能按 惯例通过任何其他的方法进行确证，因此可能出现不准确的"if断。
事实上，使用常规的管法不可能每个标本使用2个或3个以上的管， 这可归因于其导致的管堆积(仅在第一周，40个样品每天即可产生500个
快速培养法(shell vial method)是目前本领域技术人员用于病毒恢复的 最先进的方法。快速培养法使用5 ml的塑料瓶(直径16mm)和半透明的盖 子。继适当的处理后，将圆形的(13mm)盖玻片插入该瓶。将易感的细胞系 接种于瓶中，所述细胞系在盖玻片上单层生长。当单层达到约80-卯％的融 合率时，丢弃培养基并将该瓶接种上患者的标本。随后，监控孵育瓶的CPE, 继之除去盖玻片。然后将盖玻片固定于显微镜的载玻片并经由单克隆抗体 染色。
快速培养法的优势在于接种后可以通过对瓶进行离心来促进病毒的 恢复，快速培养法可将获得结果所需的时间长度缩短至2-3天。此外，使 用快速培养法无需等待可见的CPE。可以在第二或第三天除去盖玻片并使 用适当的单克隆抗体进行染色且通过使用抗体抗原染色来确证结果(特异 性的CPE)。
但是，快速培养法也有一些局限性，由于盖玻片需要下述的特殊处理 因此快速培养法是耗时的使用清洁剂和丙酮多次洗涤后以蒸馏水洗涤并 灭菌。还必须人工将盖玻片插入瓶中。
快速培养法的另 一个不利之处在于如常规的管法一样，需要每天观察 CPE。此外，需要进行荧光免疫染色时，所需的过程是复杂和耗时的。而 且必须丢弃来自快速培养的培养基并人工(使用特殊的镊子)除去盖玻片、 气干并固定于显微镜的载玻片(使用真空油脂)。由于操作的不小心，或者 无意识地将上方的单层向下倒置并固定在显微镜的载玻片上可以使盖玻 片破裂，因此盖玻片的去除是令人厌烦的。由于接种的细胞也可在盖玻片 的下方生长，从而使该盖玻片固定于所述瓶，因此出现了另一个不利的因 素(complication)。此类盖玻片的去除4艮烦瑣。
事实上，使用快速培养法不可能每个标本使用2个或3个以上的管，
这可归因于管堆积(每周40个样品每天产生500个快速培养并瓦)。此外，为 了覆盖13 mm的圆形盖玻片，荧光免疫染色需要大量的单克隆抗体。
96孔板法是仅在受限制的情况下用于恢复生长于相同细胞系的病毒 的另 一种方法(例如，该池接种LLC-MK2细胞系时，副流感病毒及流感病 毒的恢复是可能的)。单克隆抗体结合96孔板用于诊断。
该方法具有下述优势当接种细胞系时样品相对容易才喿作；可以在同 一板上接种大量的样品；经由离心的促进作用是可能的；仅需要少量的培 养基(仅为0.2mL，而不是快速培养瓶中使用的1-1.5 mL);可以使用抗原 抗体技术确证结果；并且该方法还使得容易地"读数"所监控的CPE。
然而，96孔板法需要将整个板用于抗原抗体检测，这通常很难实现。 此外，甚至当标本的数目小于整块板所需的标本数目时，也必须在同一天 使用这一整块板。这就意味着每天必须使用一套新的不同的板。而且，每 块板通常只可使用 一种或两种不同的细胞系(将相同类型的标本接种于板 上)。同样地，确证病毒检测结果的方法必须在整块板上并且同时进行。这 就不利地导致了下述情况即检测一经完成，假设结果错误或者在延长的 孵育周期后就无剩余的细胞可以用于重复所述过程。
在上述方法中，所使用的细胞培养基经常配有添加剂以允许改善病毒 的恢复。发明人已发现配有激素和酶的细胞培养基可通过下述情况有利地 优化(optimises)病毒恢复将细胞系保持在最大的敏感性以及帮助病毒连 接于细胞壁且在某种情况下，缩短获得结果所需的时间。这就得到了本发 明的病毒恢复培养基，所述病毒恢复培养基可以有利地用于所有病毒的恢 复，所述病毒适用于如下文描述所陈述的细胞培养物。
本发明还旨在提供一种试剂盒，所述试剂盒促成了用于减少已知的微 量滴定托盘组件(micro titre tray assemblies)的不利因素并提供增强病毒恢 复的快速、有效和低廉的手段，优选地，根据有待施行的特定诊断可容易 地对所述试剂盒进行改进。本发明还涉及一种使用本发明的病毒恢复培养 基检测病毒的方法。有利地，本发明提供了在迄今为止未知的应用中选择 的灵活性。
因此，本发明提供包括细胞培养基的病毒恢复培养基，所述细胞培养 基添加有至少 一种激素和至少一种酶。
如此处所用，术语"病毒恢复培养基(medium)，，或"病毒恢复培养基 (media)"指用于病毒生长和分离的培养基(medium)或培养基(media)。例如， 病毒恢复培养基包括维持培养基。
加至细胞培养基的酶无特殊限制并且本领域技术人员可以确定合适 的酶。在某些实施方案中，术语"酶"指蛋白水解酶。在这些实施方案中， 酶优选丝氨酸或天冬氨酸蛋白酶。示例性的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶或 胃蛋白酶。在优选的实施方案中，酶为胰蛋白酶。
加至细胞培养基的激素无特殊限制并且本领域技术人员可以确定合 适的激素。在某些实施方案中，术语"激素"指皮质类固醇，优选糖皮质激 素。更优选地，激素选自地塞米松、氲化可的松、醋酸可的松、泼尼松、 氢化泼尼松、甲基氢化泼尼松、倍他米松、氟羟泼尼松龙、倍氯米松、醋 酸氟氢可的杠、、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。在优选的实施方案中， 激素为地塞米松。激素可以是合成的或者是天然形成的。
虽然激素和酶的组合是最优选的实施方案，但是可选地，发现DMSO (二曱基亚砜)和DEAE (右旋糖酐)也是有用的。
加至培养基的酶的量优选在1-5吗/ml范围内，并且优选约2.5 )ag/ml。 培养基中激素的浓度优选在1(^M-10"M范围内并且优选约1(T5M。但是， 在优选地塞米松和胰蛋白酶的情况下，发现添加有约2.5吗/ml胰蛋白酶和 浓度约为1(T5M的地塞米松的细胞培养基得到了最佳结果。
因此，本发明特定的实施方案提供包括细胞培养基的病毒恢复培养 基，所述细胞培养基添加有2.5 )ig/ml的胰蛋白酶和浓度为1(T5M的地塞米 松。
可以依据本发明使用的细胞培养基无特殊的限制。例如，这些细胞培 养基可以包括培养基199、 DMEM、 RPMI-1640或MEM-EAGLE。然而， 如同公认的，存在大量可以有助于细胞生长和本领域技术人员随时可获得 的不同的培养基。但是，根据优选的实施方案，细胞培养基为 MEM-EAGLE 。
纟田胞培养基可以添加支持细胞和病毒生长的添加剂并且此类添加剂 为本领域技术人员已知。已知特定的细胞系和/或病毒可能需要用于最佳生 长和发育的特异性添加剂。示例性的添加剂包括L-谷氨酸、氨基酸、抗
生素、血清、Hanks平衡盐、如D-葡萄糖的糖类、无机盐、维生素、苯基 红、如HEPES的緩沖液以及如Tween 80的表面活性剂。
以上描述的病毒恢复培养基可以在用于鉴别病毒的常规诊断过程中 使用，所述常规诊断的例子如常规的管法和快速培养法。可选地，病毒恢
复培养基可以在下文描述的方法中使用。
根据本发明的另一个实施方案，提供了以上描述的病毒恢复培养基在
病毒检测方法中的用途。
因此，提供一种4佥测病毒的方法，包括下述步骤
(i) 提供适用于病毒接种的细胞系；
(ii) 对标本进行特异性预处理以获得潜在含有待检测病毒的样品； (m)将潜在含有待检测病毒的样品接种于细胞；
(iv) 孵育接种的细胞；
(v) 使用包括细胞培养基的病毒恢复培养基替换样品培养基，所述细 胞培养基添加有至少 一种激素和至少 一种酶；
(vi) 孵育来自(iv)的样品；和
(vii) 控-测病毒。
可以选择适用于特定病毒生长和分离的细胞系。比如，细胞系 LLC-MK2适用于副流感病毒的4企测，MDCK适用于流感病毒，HEP-2适 用于呼吸道合胞病毒(RSV)以及MRC-5适用于细胞巨化病毒(CMV)、单纯 疱渗病毒(HSV)、肠道病毒和鼻病毒。本领域技术人员可以选择适于给定 病毒生长和分离的细胞系。
如此处所用，术语"潜在含有待检测病毒的样品，，包括由受试者获得的 样品标本，所述样品标本可能受到病毒感染或未受到病毒感染。因此，样 品可含有可^^测的病毒或者无病毒。适宜的样品可以由下述物质获得唾 液、血清、尿、排泄物、脑脊液(CSF)、呼吸液，如支气管肺泡灌洗液与鼻 咽吸出物、和诸如来自嘴、鼻腔、咽喉、皮肤和生殖器的化验标本。可以 通过使用与细胞系和病毒相容的适宜介质进行稀释来制备使用的样品标 本。
受试者可以是任何可受病毒感染的动物物种。例如，受试者可以是禽 类、鱼或哺乳动物。在某些实施方案中，受试者为哺乳动物。适宜的哺乳
动物包括养殖动物，如绵羊、牛、猪、鹿等等；伴侣动物，如狗、猫、兔、 豚鼠等等；实验动物，如小鼠、大鼠、猴等等；圏养动物，如动物园和人 类圏养的动物。优选的哺乳动物为人类。在其他的实施方案中，受试者可 以是禽类，特别是养殖的禽类，如鸡和火鸡。获得适用于病毒检测的样品 的标本特异性预处理方法为本领域技术人员已知并且可以包括，但不限 于超声裂法和离心法。
根据本发明的病毒恢复培养基可以用于多种不同病毒的恢复，所述病 毒适用于细胞培养。本领域技术人员应意识到此类病毒包括，但不限于 呼吸道病毒、副流感病毒1，2,3,4(PI 1 ，2,3,4)、流感病毒A,B(InfA,B)、呼吸 道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AD)、鼻病毒(RH)、细胞巨化病毒(CMV)以及 来自肠道病毒(ENT)的病毒，所述肠道病毒选自埃可病毒、科沙奇病毒、 肠道病毒与脊髓灰质炎病毒；和非呼吸道病毒，所述非呼吸道病毒的例子 有，但不限于单纯疱渗病毒(HSV) 1,2、水痘带状疱渗病毒(VZV)、风渗、 腮腺炎、麻渗、轮状病毒和多瘤病毒。
在本发明的方法中，可以使用已知的条件将接种的细胞与样品进行孵 育。例,，可以将接种的细胞在37。C孵育一段时间以导致细胞感染病毒， 所述时间如45-90分钟，特别是60分钟。可以在培养箱中施行孵育或者可 以使用离心法施行孵育。
可以使用本领域已知的常规检测方法来检测病毒，所述常规检测方法 诸如免疫检测技术、常用的分子技术；所述免疫检测技术的例子有免疫荧 光法、染色、CPE的显像，所述常用的分子技术的例子有多聚酶链式反应 (PCR)、逆转录酶PCR (RT-PCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
根据本发明的病毒恢复培养基可以有利地、相对容易地用于多孔微量 滴定托盘组件。然而，如同公认的，存在大量本领域技术人员随时可获得 的不同的细胞培养托盘组件。例如，包括多个孔的微量滴定板是本领域公 知的。在一个实施方案中，可以使用如澳大利亚创新专利第2001100242 号所描述的托盘组件。可选地，并且根据优选的实施方案，所述微量滴定 托盘组件包括分别具有多个贮槽(receptacles)的第一、第二和第三托盘单 元；以及多个与所述贮槽配套(complimentary)的样品池，所述池分别单个 并分开地保持在所述多个贮槽内且可从所述多个贮槽中的各自的贮槽除
去；其中第二和第三托盘单元分别适合于可拆卸地啮合第一托盘单元，以 使由第一托盘单元和第二托盘单元和/或第三托盘单元组成的微量滴定托 盘能够进行组装。
虽然应理解一般优选矩形的托盘单元，但是第一、第二和第三托盘单 元也可以分别采用任何适宜的形式。在优选的实施方案中，为了提供不同 排列的贮槽来容纳具有有待分析的溶液的样品池，第一托盘单元包括以 6x8矩阵排列的48个贮槽，第二托盘单元包括以6x8矩阵排列的48个贮 槽以及第三托盘单元包括以2x8矩阵排列的16个贮槽。因此，使用第一 托盘单元和第二托盘单元可以形成两个6x8(即12x8)的微量滴定托盘，使 用第一托盘单元和第三托盘单元可以形成8x8的微量滴定托盘，以及使用 全部三个托盘单元可以形成14x8的微量滴定托盘。应理解的是可以包括 另外插入的托盘单元以达到所期望的|&槽或池数。
可以通过任何适宜的方式来实现第二和第三托盘单元与第 一托盘单 元的连接。比如，所述方式可以包括搭扣配合啮合或类似的手段。根据优 选的实施方案，当第二和第三托盘单元与第一托盘单元啮合时，第二和第 三托盘单元邻接第一托盘单元的对侧。优选地，第二和第三托盘单元包括 外缘臂，所述外缘臂可拆卸地啮合第 一托盘单元任一侧的配套套管。
在优选的实施方案中，所述池分别弹性地(resiliently)保持在各自的贮 槽中。例如，每个所述池可经由摩擦固定分别弹性地保持在各自的贮槽内。 换言之，除了因池的直径增加而嵌入各自的贮槽之外，还可以使每个池为 锥形以便所述池的基座可以嵌入各自的贮槽。其他的备选方案应由本领域 的技术人员确定。比如，所述池可以分别包括至少一个在其外表面上的脊， 所述沟啮合内壁，或者啮合第一、第二和/或第三托盘单元的各自贮槽的内 壁以产生摩擦固定。
优选地，至少一个托盘单元设置有用于鉴别保持在贮槽中的样品池的 鉴别工具。特别地，所述鉴别工具可以包括参考栅极，其中所述多个贮槽 的每排设置有相应的字母代码和所述多个贮槽的每栏设置有相应的数字 代码。
第 一、第二和第三托盘单元或其任意组合可以分别设置有配套的盖， 优选适合为样品池分别设置的单独的盖。特别地，所述盖优选包括多个圆
形的脊，当将盖放置在各自的托盘单元或多个单元时，所述脊分别环绕各 自样品池的开口以充分盖住保持在池中的样品。
在另一个实施方案中，样品池未单独和分开地保#，而是作为小单元 的样品池保持。样品池单元仅优选小单元，包括达四个的样品池。
因此，微量滴定托盘组件优选包括第一、第二和第三托盘单元，所述 第一、第二和第三托盘单元分别具有多个贮槽和多个样品池单元，其中所 述样品池单元分别包括达四个的样品池，所述样品池分别与各自的贮槽配 套，并且其中样品池单元分别作为一个单元保持在多个贮槽的一部分贮槽 内并可以从多个贮槽的一部分贮槽移出，所述多个贮槽与样品池单元的样
品池数目相对应；其中第二和第三托盘单元分别适合于可拆卸地啮合第一 托盘单元，以使由第一托盘单元和第二托盘单元和/或第三托盘单元组成的 微量滴定托盘能够进行组装。
根据此实施方案，可以根据有待施行的特定诊断来构建包括达四个样 品池的样品池单元。例如，可能期望提供两份相同的样品以便可以进行双 重分析。在某些实施方案中，对托盘单元进行构建以便在组件每排或每栏 中的贮槽数目与每个样品池单元中样品池的数目相对应。
可以根据需要制造样品池单元。基于这点考虑，每个样品池单元的样 品池可以整体地形成，或者;f皮此可以拆卸以形成单独的样品池。对于这两 种选择的后者而言，应理解的是可以使用适合将小塑料物品彼此可拆卸地 接合的任何方式来实现单个样品池的连接。
根据本发明的又一方面，提供了一种病毒诊断试剂盒，所述病毒诊断 试剂盒包括本发明的病毒恢复培养基、如上描述的微量滴定托盘组件和任 选地适合于将样品池或样品池单元从微量滴定板除去的镊子。
所述镊子可以采用任何适宜的形状，条件是所述镊子的形状可以方便 的抓牢单个样品池或包括达四个样品池的样品池单元。在优选的实施方案 中，包括有待插入池中的第一部分和与第一部分协作并抓牢所述池外表面 的第二部分的镊子特别适用于所述目的。第一部分优选具有圆形的截面并
且优选具有当插入池中时与所述池的内壁仅有最小间隙的尺寸。
以上描迷的组件和病毒恢复培养基可以提供超过已知方法和当前可 获得的组件的特定优势。特别地，该组件和溶液可以促使增加敏感性并针
对相同的标本使用五种或更多的高度特异性细胞系。此外，可以实现经由 离心的促进作用。基于这点考虑，离心力促进病毒的吸收并且因此缩短了
病毒检测的时间，在某些情况下，可将病毒检测的时间缩短10倍。此外， 可以在一个盘上接种8-16种之间的样品，使得通过一名操作人员即可处理 更多的样品。而且，通过第一、第二和第三托盘单元来提供组件设计中的 增强的灵活性。
可以通过采用该组件和溶液的方法使用依赖于荧光或酶标记以及在 1-2天内产生可获得的(80。/。的普通病毒)确证结果的快速^r测技术来提供增 加的客观性。基于这点考虑，由于可以利用高达14种不同的细胞系来允 许大范围的病毒有待使用不同的单克隆抗体组合进行检测，因此该组件是 通用的。也可以监控CPE。此外，由于可以将标本接种于不同的细胞系， 因此可以在不同的细胞系上并且在不同的时限内使用不同的单克隆。在出
结合该组件和溶液使用的方法还可以通过使结果在-3天内获得来提 供节省时间的益处。这样的方法在实践工作中表现出大量的节约。如所举 的例子一样，因为一次试-睑仅需少量的单克隆抗体(与使用快速培养法一次 试验所需的60-80 )Lil的单克隆抗体相比，为20 (il)，所以该组件还使得枱r
验的成本有效。
在使用中，将盘接种多种细胞系。用于检测的细胞系的选择取决于标 本的类型和期望的病毒的存在。例如，未将本发明限制于特定的细胞系 LLC-MK2细胞系可用于副流感病毒的检测，MDCK可用于流感病毒， HEP-2适用于RSV以及MRC-5细胞系适用于CMV、 HSV、肠道病毒和 鼻病毒的分离。继接种之后，随后将标本分别接种于盘上不同的排。举例 说明，如果该盘为8x12,则每盘可以接种8种不同的标本，每种标本可以 接种入任意给定排的高达12种不同细胞系的12个池中。这就有利地促进 了至少十二种病毒的检测。但是，应理解的是可以根据明确的诊断需求来 改变这种96孔板的构形。上述方法仅需要对细胞系选择作出适当的改进
本发明逸过参考以下的非限制性附图和/或实施例作进一步描述。
目前参考附图，所述附图展示在本发明 一方面的试剂盒中与病毒恢复
培养基一起使用的托盘的实施方案，其中
图l展示分解形式的第一、第二和第三托盘单元；
图2^_示组装形式的第一、第二和第三托盘单元；
图3展示半组装形式的第一和第二托盘单元；
图4展示组装形式的第一和第三托盘单元；
图5展示多个样品池；及
图6展示典型的12x8矩阵孔构形。
参考

图1，设置托盘组件10,所述托盘组件10包括第一托盘单元11、 第二托盘单元12和第三托盘单元13。托盘单元11、 12和13分别包括多 个贮槽14，所述贮槽14适合于容纳单个的样品池(参见图5)或者由达四个 单个的样品池组成的样品池单元。
第一托盘单元11包括沿着所述第一托盘单元11外边缘的套管15。套 管15适合于一侧容纳第二托盘单元的外缘臂16和对侧容纳第三托盘单元 的外缘臂17。同样地，可以通过将外缘臂16、 17滑入第一托盘单元11的 套管15来使第二和第三托盘单元12、 13与第一托盘单元11可拆卸地啮合 成如图2所展示的最佳状态。图3特别充分地展示了第一和第二托盘单元 的啮合。
参考图5,样品池50分别有利地包括锥形的主体51 、基座52和界定 池50的开口的环形唇53。使用此构形，可以将池分别弹性地保持在第一、 第二或第三托盘单元的各自的贮槽内并且可以根据需要除去。
图6示例性地展示典型的12x8孔板构形(即2x6x8)的例子，包括有待 检测的病毒列表、相关的细胞系和每种细胞系的除去天数。
如图6所示，该板可以按照以下顺序接种不同的细胞系
1-3栏 LLC-MK2
4、 5栏 MDCK
6栏 Hep2
7栏 A549
8栏 RK13
9-12柱 MRC-5
以此样式设置的板将允许选择诸如下述的病毒，但是不限于呼吸道 病毒副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A，B (Inf A,B)、 RSV、腺病 毒(AD)、鼻病毒(RH)、细胞巨化病毒(CMV)和来自肠道病毒(ENT)的病毒， 所述肠道病毒选自埃可病毒(Eco)、科沙奇病毒(cox)、肠道病毒(Ent)与脊髓 灰质炎病毒(Polio);以及但不限于非呼吸道病毒——单纯疱疹病毒(HSV) 1,2与水痘带状疱渗病毒(VZV)。
在另外的实施例中，6x8孔板的构形可以由下述顺序接种的细胞系组
成
1-3栏 A 549 4-6栏 MRC-5
这可允许用于例如以下病毒的检测，例子有CMV、 HSV1，2、 VZV、 AD和来自肠道病毒的病毒。
最后，14x8孔的构形可允许最终用于病原体的纟佥测，所述病原体如 PI1，2，3,4、 Inf A,B、 RSV、 AD、 RH、 ENT (Echo, cox, Ent, Polio)、 HSV 1,2、 vzv、风渗、腮腺炎、麻渗、轮状病毒、多瘤病毒以及其他使用合适的细
胞系的病原体病毒。
由于池的独立的性质，可以根据适用于正在讨i仑的特定病毒^r测的时 间表来选择除去的细胞系。特别地，取A排进行举例，如果期望检测PI1-4, 则在第二天除去池A1-A3;如果期望检测InfA,B,则在第二天除去池A4 和A5。然而，如果需要检测肠病毒，则随后在合适的天数(l-3)除去池All。 独立池的独特性质使得这种选择除去和病毒检测更加容易进行。
现在参考特定的过程使用本发明一方面的试剂盒，其中许多步骤可以 进行优化并且不应认为其以任何方式限制本发明。
使用真空灭菌的玻璃巴斯德吸管从有待接种的所有池中吸出培养基。 在大的细长容器中丢弃巴斯德吸管是有利的。
使用一次性吸管使孔板合适数目的池接种有约每池150-200 jal的标 本。剩余的样品在-7(TC保存。随后将盖放置在板上并于板中培养的池上方 i己录日期。
然后将板在数字天平上称重并使用平衡板和平衡卡进行平衡直到所 有的板等重(+A0.5g)并且能够在离心中平衡。离心机在37。C和以3500 rpm
运行60 min。然后使用真空灭菌的巴斯德吸管分别从每个池中吸出标本， 并且将每个池填充上本发明的病毒恢复培养基，其中每个标本均使用干净 的一次性吸管。
随后在聂后的标本接种后通过将板小心地放入(302培养箱并在37°C 孵育达七天来使样品在37。C的C02培养箱(5。/。)中的潮湿环境下孵育。
通过使用特异性的单克隆抗体，可以有利地将荧光免疫染色用于单个 池中特定病毒的检测。通常，随后的过程如下使用真空吸引器从合适的 池中除去培养基并使用专用的镊子从该板除去所述池并转移入不同的支 架。然后将这些物体气干5分钟。然后将300 pl的冷丙酮加至每个池并允 许在-20。C固定15分钟。随后丢弃固定液并将样品再次气干2-3分钟。然 后分别往池中加入特异性的单克隆抗体(一抗)并将盖有盖子的板置入适当 的位置中，且将样品在'37。C孵育30分钟。然后从培养箱中移出样品并且 分别往池中添加PBS。随后丢弃PBS。此过程重复四次以上。再次将样品 气干5分钟，之后分别往池中加入二抗。该步骤后，再次进行样品的孵育， 继之使用如上所述的PBS重复处理且最终使用双蒸水洗涤。然后加入少量 (1滴)专门制备的封片介质并在荧光显微镜下观察结果。
除非上下文另有要求，否则遍及本说明书和随后的权利要求的词"包括 (comprise)"及其变体如"包括(comprises)"和"包括(comprising)"应理解为包 含所规定的整体或整体组合或步骤而不排除任何其他的整体或整体组合 或步骤。
本领域技术人员应理解，除了专门描述的之外，可以对此处描述的本 发明进行变化和改进。有待理解的是本发明包括所有这样的变化和改进。 本发明还个别或全体地包括说明书中涉及或预示的所有步骤、特征、组合 物和化合物，以及任意两种或多种所述步骤或特征的任意和全部的组合。
权利要求
1.一种病毒恢复培养基，其包括细胞培养基，所述细胞培养基添加有至少一种激素和至少一种酶。
2. 根据权利要求1所述的病毒恢复培养基，其中所述激素为糖皮质 激素。
3. 根据权利要求2所述的病毒恢复培养基，其中所述激素选自地塞 米松、氢化可的松、醋酸可的松、泼尼松、氬化泼尼松、曱基氢化泼尼松、 倍他米松、氟羟泼尼松龙、倍氯米松、醋酸氟氬可的松、醋酸脱氧皮质酮 (DOCA)和酪固酮。
4. 根据权利要求3所述的病毒恢复培养基，其中所述激素为地塞米松。
5. 根据权利要求1所述的病毒恢复培养基，其中所述酶为丝氨酸或 天冬氨酸蛋白酶。
6. 根据权利要求5所述的病毒恢复培养基，其中所述酶选自胰蛋白 酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶。
7. 裉据权利要求6所述的病毒恢复培养基，其中所述酶为胰蛋白酶。
8. 根据权利要求1所述的病毒恢复培养基，其中所述酶以1至5 |ig/mL 的范围，特别是约2.5(ig/mL的量存在。
9. 根据权利要求1所述的病毒恢复培养基，其中所述激素以104至 10—6 M的浓麽.，特别是约10—5 M的浓度存在。
10. —种检测病毒的方法，其包括(i) 提供适用于病毒接种的细胞系；(ii) 对标本进行特异性预处理以获得潜在含有待检测病毒的样品；(iii) 使用潜在含有待检测病毒的样品接种细胞；(iv) 孵育接种的细胞；(v) 使用包括细胞培养基的病毒恢复培养基替换样品培养基，所述细 胞培养基添加有至少 一种激素和至少 一种酶；(vii)检测所述病毒。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中所述激素为糖皮质激素。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述激素选自地塞米松、氢化 可的松、醋酸可的松、泼尼松、氢化泼尼松、曱基氲化泼尼松、倍他米松、 氟羟泼尼松龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。根据权利要求12所述的方法，其中所述激素为地塞米^^。 根据权利要求10所述的方法，其中所述酶为丝氨酸或天冬氨酸
13.
14.蛋白酶。
15. 白酶、J
16.根据权利要求14所述的病毒恢复培养基，其中所述酶选自胰蛋 L蛋白酶和胃蛋白酶。根据权利要求15所述的病毒恢复培养基，其中所述酶为胰蛋白
17. 根据权利要求10所述的病毒恢复培养基，其中所述酶以1至5 pg/mL的范围，特别是约2.5吗/mL的量存在。
18. 根据权利要求10所述的病毒恢复培养基，其中所述激素以104 至10^M的浓度，特别是约10^M的浓度存在。
19. 一种病毒"^断试剂盒，其包括(i) 病毒恢复培养基，所述病毒恢复培养基包括细胞培养基，所述细胞 培养基添加有至少一种激素和至少一种酶；和(ii) ^:量滴定托盘组件。
20. 根据秋利要求19所述的病毒诊断试剂盒，其中所述微量滴定托 盘组件包括多个相互连接但可拆卸的微量滴定托盘。'
全文摘要
本发明涉及一种病毒恢复培养基及包括该病毒恢复培养基的病毒诊断试剂盒。所述病毒恢复培养基添加有激素和酶。所述激素优选糖皮质激素，更优选地塞米松。所述酶优选蛋白酶，更优选胰蛋白酶。
文档编号C12N5/02GK101103102SQ200680002001
公开日2008年1月9日 申请日期2006年1月13日 优先权日2005年1月14日
发明者罗伯特·亚历山大 申请人:罗伯特·亚历山大