使用同一样本的二阶段核酸检测方法

专利名称：使用同一样本的二阶段核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测样本核酸中是否含有目的序列的方法。由于生物
具有的DNA的碱基序列根据个体、种类、生存地方等而不同，通过利用本发明的检测方法，可以判定生物的个体、种类、生存地方等。此外，最近，食品中添加表示的封条的伪装和基因重组体混入食品等正成为问题，本发明的检测方法也可以用于这些伪装和混入的判定。
背景技术：
一般而言，金枪鱼可以分为太平洋产蓝鳍金枪鱼(Thunus thynnus)、大西洋产蓝鳍金枪鱼、南方蓝鳍金枪鱼、云裳金枪鱼、黄肌金枪鱼和长鳍金枪鱼等。迄今为止，根据DNA对金枪鱼的种类进行判定时， 一直使用的是称为聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR - RFLP(例如，参照非专利文献l))的方法(例如，参照非专利文献2)。该方法是用PCR法(例如，参照非专利文献3)扩增被检DNA后，通过在种、系统、个体中特异的tt序列部位切断DNA进行判别的方法，根据扩增的DNA的区域和切断DNA的限制性酶的种类、以及被切断DNA所产生的DNA片段的数目和各DNA片段的长度来判断种、系统、个体。例如，在太平洋产蓝鳍金枪鱼中，选择粒线体DNA的ATCO区域，以其作为被检DNA进行PCR扩增后，如果用限制性酶AluI切断，被切断为5个DNA片段，各个DNA片段的长度为432个威基、295个碱基、81个碱基、66个威基、41个碱基，如果用限制性酶MseI切断，被切断为8个DNA片段，各个DNA片段的长度为255个碱基、254个碱基、194个碱基、115个4^、 41个^4&、 32个碱基、15个碱基、9个4^，如果用限制性酶Tsp509I切断，被切断为6个DNA片段，各个DNA片段的长度为417个^J^、 217个4^、 186个4^、 72个4^、 15个>^、 8个4^(例 如，参照非专利文献2)。
此外，在基因重组体的判別检测中也可以使用与上勤目同的方法。非专利文献l
G R Deng 、"A sensitive non-radioactive PCR-RFLP
analysis for detecting point mutations at 12th codon of oncogene c-Ha-ras in DNAs of gastric cancer." Nucleic Acids Res. 1988 July 11; 16(13): 6231。
非专利文献2独立行政法人农林7JC产消费技术中心.独立行政法 人水产综合研究中心"技术信息金枪鱼属鱼类的鱼种判断手册，，
非专利文献3
Mullis K及其他五人，Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 Pt 1:263-73。
发明的公开 发明要解决的问题
上述PCR- RFLP法，是通过被限制性酶切断的DNA片段的数量和各 DNA片段的长度的差异进行判别的方法。具体而言是，用电泳分离被切断 的所有DNA片段，分离的各个DNA片段以条带形式出现。此时，分离后渐 渐出现的条带的数目就是DNA片段的数目，经电泳泳动的距离为DNA片段 的长度。电泳是一种利用长度短的DNA片段快速泳动，长的DNA片段泳动 得慢的作用的分离方法，可以根据泳动的距离求出长度。
但是，切断产生的DNA片段中，类似长度的DNA片段有多条时，通过 电泳无法充分分离，即使存在2个DNA片段也只看到1个条带(例如，前述非 专利文献2中公开的凝胶电泳的荧光染色图像中，即使用3。/。(w/v)的琼脂糖 凝胶对255个碱基长和254个威基长的2种DNA片段电泳4cm左右的距离，也 只检测出一条粗条带)。因此，如果在生成类似长度的DNA片段的条件下 进行PCR-RFLP，就存在误判DNA片段的数目的危险性。这样一来，由 于PCR-RFLP法可信度不高，就存在不能面对重要的检测的问题。
进而，这种类似长度的DNA片段无法分离的现象是使用PCR - RTLP和电泳的检测手法中共同的问题。因此，采用电泳求得DNA片段的数目的 定性PCR法等检测方法(例如，特开2003-009866号公报，根据SINE法进行 动物种类判别的方法，对于重组DNA技术应用食品的检测方法((平成13年 3月27日宣布的食品第110号)(附件)重组DNA技术应用食品的检测方法)该 文献可以从社会福利卫生劳动部的主页下载。 <参照 http:〃www.mhlw.go.ip/toDics/ideiishi/kensa/050517a.html >)，不限于PCR -RFLP，由于可信度不高，因此存在不能面对重要的检测的问题。
另 一方面，可信度最高的检测方法是通过读取DNA的^序列进行检 测的方法(例如，参照Sambrook J & Russell DW Chapter12 DNA sequencing. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3rd Ed. 2001; ppl2.l-12.120)。但是，该方法存在成本高，只可以在有特殊设备和熟练技 术人员的专门机构中进行，在通常的反复多次检测中使用时并是不合适的 检测方法这样的问题。
本发明鉴于这些以往的技术问题，旨在使用DNA，提供一种比以往的 方法更为有效的检测方法。
用于解决问题的方法
技术领域：
本发明者为了解决上述问题反复进行了积极的研究，结果发现，在检 测样本核酸中是否含有目的序列时，通过分成简易检测和精密检测这二阶 段进行检测，可以以低成本实施可信度高的检测，基于这种认识，完成了 本发明。
也就是说，本发明提供了以下的(1) ~ (12)。
(1) 核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有目的序列的 方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易检测，判定为含有或不含有目 的序列时，对同一样^fe酸进行精密检测。
(2) 核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有规定量或规 定量以上的目的序列的方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易的定量 检测，判定为含有规定量或规定量以上的目的序列时，对同一样本核酸进行精密检测。
(3) 根据(1)或(2)中记载的核酸的检测方法，其特征在于所述精密检测是 读取样^酸的^5^&序列的检测。
(4) 才艮据(l)-(3)任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于回收通过 简易检测判定为含有或不含目的序列的核酸，或者回收通过简易检测判定 为含有规定量或规定量以上的目的序列的核酸，对该核酸进行精密检测。
(5) 根据(4)中记栽的核酸的检测方法，其特征在于预先给样本核酸添 加标记，在简易检测结束后，利用标记回收样本核酸。
(6) 根据(4)中记栽的核酸的检测方法，其特征在于在简易检测结束后， 利用样本核酸与其它物质的物理化学的差异的方法回收样本核酸。
(7) 根据(l)-(6)任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于简易检测 是使样本核酸不破损的检测。
(8) 根据(l)-(6)任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于简易检测 是可以保持读取样本核酸的g序列状态的检测。
(9) 根据(1)或(2)中记载的核酸的检测方法，其特征在于将样本核酸分 成两份， 一份作为简易检测的样本核酸，另一份作为精密检测的样本核酸。
(10) 根据(l)-(9)任一项中记栽的核酸的检测方法，其特征在于目的序 列是生物种类中特异性存在的序列。
(11) 根据(l)-(9)任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于目的序 列是基因重组体中特异性存在的序列。
(12) 根据(l)-(9)任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于可以用 一次简易检测同时检测多种目的序列。
发明的效果
本发明发挥了如下记载的效杲。
如上述(1)或(2)的方法，通常，通过实施不需要特殊设备和熟练技术人 员的可以在短时间内便宜地获得检测结果的第l阶段的简易检测，发生问题 时进行第2阶段的精密检测这二阶段的检测方法，可以有效且高可信度地进此外，如上述(3)的方法，如果通过第2阶段的使用读取核酸的碱基序 列的方法作为精密检测的方式，由于该方法是可信度最高的核酸的一级结 构的分析检测方法，因此即使第l阶段的简易检测中使用任意方法，都可以 最终确保高可信度的检测。
此外，如上述(4)的方法，如果通过回收简易检测中使用的样本核酸， 再次使用来进行精密检测的方法，可以减少检测过程中取错对象等失误， 提供可信度更高的检测手段。进而，通过再次使用，也可以减少检测中使 用的核酸的量。
此外，如上述(5)的方法，如果通过利用预先添加在样本核酸上的标记， 在简易检测终止后回收样本核酸的方式，可以从未添加标记的混合物中有 效地回收样本核酸。
此外，如上述(6)的方法，如果通过利用样本核酸与其它物质之间的物 理化学的差异，在简易检测终止后回收样本核酸的方式，不需要预先给样 ;^fe酸添加标记，就可以回收样本核酸。
此外，如上述(7)的方法，如果通过采用使样本核酸不破损就可以回收 的简易检测方法的方式，可以在第2阶段的精密检测中再次使用第1阶段的 简易检测中使用的样本核酸，因此可以通过减少在检测过程中取错对象等 失误，提供可信度更高的检测手段。进而，通过再次使用，也可以减少检 测中使用的核酸的量。
此外，如上述(8)的方法，如果采用为了能够读取核酸的碱基序列而进 行简易检测方法的方式，可以在第2阶段的读取核酸的^序列的精密检测 中再次使用第1阶段的简易检测中使用的样^4玄酸，因此可以最终确保高可 信度的检测，同时，也可以通过减少在检测过程中取错对象等失误，提供 可信度更高的检测手段，此外，通过再次使用，也可以减少检测中使用的 核酸的量。
此外，如上述(9)的方法，预先将样本核酸分成简易检测用和精密检测 用来保存，如果按照各种检测中使用的检测方法，即使在第l阶段的简易检测使样4^t酸破损的情况下，可以预先确保第2阶段用的样本核酸。进而， 如果预先将分隔开的各核酸样本装在同一装置上，也可以减少取错对象等 失误。
此外，如上述(12)的方法，如果通过可以在一次简易检测中同时检测 多种目的序列的方法，可以 一次进行多个目的序列的检测。
附图的简要说明


图1是说明二阶段的DNA检测方法中，采用在第l阶段的简易检测 中不使样本DNA破损的方法的情况下的流程图。
图2是说明二阶段的DNA检测方法中，采用在第l阶段的筒易检测 中使样本DNA破损的方法的情况下的流程图。
图3是表示准备检测对象生物的样本DNA的流程图。
图4是回收第1阶段的简易检测中使用的样本DNA,然后进行第2 阶段的精密检测的二阶段检测的流程图。
图5是表示使用检测前分别保存于同一装置上的样本DNA的每一 部分，进行第1阶段的简易检测和第2阶段的精密检测，即二阶段检测的流 程图。
图6是表示使用微观流体技术的检测装置的图。
图7是表示图6的检测装置的盖打开状态的图。
图8是表示与实施例l的检测中使用的各DNA的碱基序列的互补性的图。
图9是表示实施例l的第l阶段的简易检测结果的图。图10是表示实施例1的第2阶段的精密检测结果的图。图11是表示与实施例2的检测中使用的各DNA的碱基序列的互补 性的图。
图12是表示实施例2的第1阶段的简易检测的结果的增殖曲线的图。图13是表示实施例2的第1阶段的简易检测中成功扩增DNA的图。图14是根据实施例2的第1阶段的简易检测的结果绘制的校正曲线的图。
图15是表示实施例2的笫2阶段的精密检测的结果的图。 符号的说明 l被检测生物组 2净皮检测生物的核酸 3样本DNA 4目的M序列部分 5磁力小珠
6结合了小珠的样本DNA
7结合了小珠的样本DNA群
8焚光色素
9探针DNA
IO荧光标记探针
ll荧光标记探针群
12未反应的荧光标记探针群
13双链形成
1W兹力吸液管
15DNA碱基序列
16被切断的长DNA片段
17被切断的中等程度长度的DNA片段18被切断的短DNA片段
19电泳凝胶
20电泳装置
21DNA提取部
22检测部
23DNA保存部
24盖
25样本插入用的孔26样本DNA的4^序列
27目的4^基序列i
28探针碱基序列
29测序引物的M序列
30阴性对照探针的碱基序列
31目的碱基序列ii
32RT引物〔1〕的^^序列
33RT引物〔2〕的4^序列
34目的碱基序列ii的互补链的4^序列
用于实施发明的最佳方式
以下，对本发明进行详细的说明。
本发明的第 一个检测方法是检测样本核酸中是否含有目的序列的方 法，其特征在于最初对样本核酸进行筒易检测，判定为含有或不含有目的 序列时，对同一样本核酸进行精密检测。本发明的第二个检测方法是检测 样本核酸中是否含有规定量或规定量以上的目的序列的方法，其特征在于 最初对样本核酸进行简易的定量检测，判定为含有规定量或规定量以上的 目的序列时，对同一样本核酸进行精密检测。如此将检测分成二阶段，只 在有问题时进行精密检测，可以以最合适的成本提供高可信度的检测。这 种方法是适应发生问题件数少的状况的检测方法。
对作为检测对象的序列没有特别的限定，但是由于本发明的检测方法， 可以主要在生物的种类等判别和基因重组体的判定等中利用，因此其可以 生物的种类、生存地方、个体中特异性存在的序列或基因重组体中特异性 存在的序列等作为检测对象。与这种特异性序列相关的信息是众所周知的。 例如，有关金枪鱼的种类、生存地方的特异性序列的信息记载于前述的非 专利文献3中(该文献可以从独立行政法人农林水产消费技术中心的主页下 载。< URL:http:〃www.cfqlcs.go.jp/technica1—information/hi叩you/pdf/ma guro—manual.pdf >)。此夕卜，红色皇帝蟹(Paralithodes camtschatica)和蓝色皇帝蟹(Paralithodes platypus)的种特异性序列的信息记载于宇山博人、池 田实、谷口顺彦"mtDNAOPCR-RFLP仁丄6夕，^力'-i:ry，力'-0判 别"，水产育种2005; 34:111中，六线鱼科鱼类的种特异性序列的信息记 载于柳本卓、滨津友纪"日本産:r一于乂科魚類7種(DmtDNA(DPCR—RFLP分析 ^上3種判別"、日本水产学会志2003;69(5):726中。此外，鲷的鱼种中特 异性序列的信息记载于"技術情報7^一、于y一及t^年^V(D魚種判別7二 工7々"(该文献可以从独立行政法人农林水产消费技术中心的主页下载。 < URL: http:〃www.cfqlcs.go.jp/technica1—information/hinpyou/pdf/ma dai一manual.pdf〉)，舻(久X《)和Citherinus latus(大4》乂《一 千)的鱼种中
特异性序列的信息记载于"只x、年、夕,U夕只X、年招J:rj 于,/w^—于(D魚 種判別7二工7々"(此文献可以从独立行政法人农林水产消费技术中心的
主页下载。< URL: http:yVwww.cfqlcs.go.jp/technical_information/hinpyou /pdf/suzuki—manual.pdf))中。此外，日本产鲭鱼属的种特异性序列的信息 记载于特开2002-345498号公报"日本産廿八属O種判別方法"中。进而，对 于基因重组体中特异性序列的信息，承认基于卡塔赫纳议定书第1种和第2 种使用规程的基因重组体，可以通过参照LMO相关信息"力少夕厶于法i二 基d含承認S;Ti力c遺伝子組^換免生物検索卜7亍厶，，(该文献可以从生物安 全信息交换所(J _ BCH)的主页下栽< URL: https:〃ch.biodic.go.jp/bch/ OpenSearch.do >沐获得。
如果是本领域技术人员，则可以容易地获得这些之外的特异性序列的 信息。并且，作为检测对象的序列，除了DNA序列外，还包括RNA序列。
对简易检测方法没有特别的限定，但是在回收由简易检测判定为含有 或不含有目的序列的核酸，作为精密检测的对象时，理想的是不使样本核 酸破损的方法。在将样本核酸分成两份，将其中一份作为简易检测的样本 核酸，另一份作为精密检测的样本核酸时，可以是使样本核酸破损的方法 或不使样本祐酸破损的方法的任 一 方法。作为使样#酸破损的方法的具 体实例，可以例举有RFLP法、PCR-RFLP法、AFLP法、southern印迹 法、化学切割错配法(Chemical Cleavage of Mismatch)(CCM)法、利用核酸酶的方法等，但不仅限于这些方法。此外，作为不使样;Mt酸破损的方法 的具体实例，可以例举有利用溶液中的杂交的方法、实时PCR法、引物延 伸法、测序法、扩增片段多态性法(Random amplified polymorphic DNA 法)、Taqman测试、Invader测试等，但不仅限于这些方法。
对核酸的回收方法没有特别的限定，但是优选预先给样本核酸添加标 记，在简易检测终止后，利用该标记回收样本核酸的方法。此外，也可以 在简易检测终止后，通过利用样本核酸与其它物质的物理化学的差异而回 收样本核酸。这里，作为利用物理化学的差异的回收方法，可以例举有通 过利用柱、电泳、有机溶剂提取等。
此外，利用微观流体技术等通过将第l阶段的简易检测的装置微芯片 化，可以由小型机器进行自动检测，进而，在简易检测终止后，将回收的 样本核酸原样封入^t芯片，可以连^:芯片一起保存或可以安全且容易地传 递到第2阶段的精密检测的场所。当精密检测时，可以从该微芯片中回收样 本核酸，用其进行检测。
对精密检测方法没有特别的限定，但是优选读取样本核酸的碱基序列 的检测方法。
以下、用图说明本发明的检测方法的优选方式。
图l是在本发明的检测方法中，采用不使样;Mt酸破损的方法进行简易 检测，对简易检测中使用的样本DNA进行回收时的流程进行说明的图。首 先，从作为检测对象的生物(S101)中提取含有样本核酸的DNA (S102)，用 其进行第l阶段的简易检测(S103)。接着，判断简易检测的结果(S104)， 如果没有问题，以该结果作为结论，终止检测(S105)。在简易检测的结杲 中存在问题时，将在第1阶段的简易检测中判定为存在问题的样W酸回收 并纯化(S106)，用其进行第2阶段的精密检测(S107)，判断结果，而后终止 (S108)。
图2对在本发明的检测方法中，采用使样本核酸破损的方法进行简易检 测时的流程进行说明。首先，从作为检测对象的生物(S201)中提取含有样 本DNA的DNA(S202)。接着，预先将样本DNA分置于同 一装置上保存(S203)，使用分置的样本DNA的一部分进行第1阶段的简易检测(S204)。接 着，判断简易检测的结果(S205)，如果没有问题，以该结果作为结论，终 止检测(S206)。在简易检测的结果中判断存在问题时，使用分开保存的第2 阶段用的样本DNA(S207)进行第2阶段的精密检测(S208),判断结果，而后 终止(S209)。
根据以上内容，通过用于实施本发明的优选实施方案，进行不需要专 门的机器和技术人员就可以简易便宜地进行的第l阶段的简易检测，由于如 果该结果中存在问题，再次使用同一样本DNA，进行高可信度的第2阶段 的精密检测这样的两阶段检测成为可能，因此可以提供可信度更高的检测。 并且，本发明中，作为第2阶段的精密检测，采用目前可信度最高的读取 DNA的碱基序列的方法。因此，即使第l阶段的简易检测中存在问题，也 可以最终提供可信度最高的检测结果。
接着，对用于实施使用不使样本DNA破损的方法来进行第1阶段的简 易检测，使用从中回收的样本DNA进行第2阶段的精密检测的方法的最佳 方案进行说明。
图3对准备检测对象生物的样本DNA的流程进行说明，图4对回收第1 阶段的检测A中使用的样本DNA，再次使用来进行第2阶段的检测B时的检 测方法的流程进行说明。首先，从如图3(a)例示的多种被检测生物組l中， 通过/^知的方法(参照例如，Sambrook J & Russell DW Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3rd Ed. 2001; pp6.1-6.64、和Sambrook J & Russell DW Chapter7 Extraction, purification, and analysis of mRNA from eukaryotic cells. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3rd Ed. 2001; pp7.1-7.94.)提取(b)这样的被检测生物的核酸2。,皮检测生物也可以是 该图所示之外的被检测生物。根据需要，对其部分扩增和/或逆转录，获得 像(c)这样的必需量的样本DNA3。该样本DNA3，如图4(a)所示，鉴定是否 含有目的g序列部分4，这是本发明的检测方法的目的。图4中，对作为 不使样本DNA破损的第1阶段的筒易检测A的实例，通过DNA杂交，作为第2阶段的精密检测B的DNA碱基序列的读取，在两阶段中使用同一样本 DNA3进行各检测时的流程进行了说明。由于杂交不使样本DNA破损，反 应体系远比DNA的M序列分析更简单，成本也便宜，因此是与在检测后 回收样本DNA这样的简易检测相适应的检测方法。
首先，如图4的(b)所示，在检测前，使样本DNA3的末端结合磁力小珠 5，制备结合了小珠的样本DNA6，使用具有该结构的分子群即结合了小珠 的样本DNA群7，进行二阶段检测。通过这种操作，第1阶段的检测A终止 后，通过磁铁的引力从夹杂物中只纯化回收该分子群，可以在第2阶段的检 测B中使用。
制作了结合了小珠的样本DNA群7后，首先，进行第l阶段的简易检测 即DNA杂交。为此，如(c)所示，制备具有与目的碱基序列部分4互补的碱 基序列的探针DNA9的末端上结合有荧光色素8的荧光标记探针IO，将这些 分子群即焚光标记探针群11的溶液和结合了小珠的样本DNA群7的溶液放 入同一反应槽中混和。此时，荧光标记探针群ll的分子数，与结合了小珠 的样本DNA群7的分子数相比过剩。通过将其连同反应槽加热后，徐徐冷 却，保持在适当温度，如(d)所示，使反应液中结合了小珠的样本DNA6中 的目的碱基序列部分4与焚光标记探针10杂交，可以进行双链形成13。通过 该双链形成13，可以使荧光色素8与目的g序列部分4间接地结合，如果 检测这些荧光色素发出的荧光，可以检测反应液中存在目的碱基序列部分 4。
但是，由于该反应液中，荧光标记探针群11与结合了小珠的样本DNA 群7相比，存在过剩量，残留了不与目的g序列部分4进行双链形成13的 剩余的未反应荧光标记探针群12，它们也发出荧光。因此，有必要通过除 去这些未反应的焚光标记探针群12，通过进行了双链形成的焚光标记揮:针 IO只检测荧光，进行正确的检测。为此，本发明中，用^f兹力吸液管14，通 过磁力吸引并固定反应液中的磁力小珠。由此，如(e)所示，可以用磁力吸 液管只回收与结合了小珠的样本DNA6和存在于其内部的目的碱基序列部 分4形成双链的荧光标记探针IO,反应液中所含的未反应的萸光标记探针群12残留在反应槽中，只回收需要的分子。然后，如(f)所示，将回收的结合 了小珠的样本DNA6和与其形成双链的荧光标记探针10悬浮于新的溶液 中。通过检测该溶液的荧光，可以检测样本DNA3中存在目的碱基序列部 分4。如果该检测结果存在问题，就回收样本DNA进行第2阶段的检测B。 该阶段中，第1阶段的简易检测A终止后的溶液中存在结合了小珠的样
10。其中，只有结合了小珠的样本DNA6是第2阶段的精密检测B所需要的， 由于荧光标记探针10成为阻碍第2阶段的精密检测B的夹杂物，需要在第2 阶段的精密检测B前，只纯化回收结合了小珠的样本DNA6。因此本发明中， 在第1阶段的检测A终止后，如(g)所示，连反应槽一起加热溶液，通过热变 性使形成双链的氢键解离后，如(h)所示，可以通过使用磁力吸液管14只回 收反应液中结合了小珠的样本DNA6，反应液中所含的解离的荧光标记探 针10残留在反应槽中，只回收需要的分子。
此后，如(i)所示，将结合了小珠的样本DNA悬浮于用于读M^基序列 的溶液中，再使用这种溶液，通过公知的方法(参照例如，前述SambrookJ 等人的文献)，进行第2阶段的精密检测B即DNA碱基序列的读取，检测存 在于样本DNA3中的目的碱基序列部分4的^J^序列15 (j)。
根据以上内容，如果按照本实施方案，简单且便宜地进行第l阶段的检 测A，如果结果中存在问题，通过回收第1阶段A中使用的样本DNA,并再 次使用，可以进行可信度高的第2阶段的精密检测B。
接着，在第1阶段的简易检测A中使用像使样本DNA破损这样的方法 时，将样本DNA预先分成第1阶段A用和第2阶段B用，保存于同一装置上， 就用于采用各检测中分开的样本DNA进行精密检测的优选方案进行说明。 图5对采用含有DNA的切断的PCR - RFLP法作为第1阶段的简易检测A时 的、采用分开保存的样本DNA的二阶段检测的流程进行说明。
首先，与再次使用样本DNA的前述的情况相同，按制备检测对象生物 的样本DNA的流程进行说明的图3，获得需要量的样本DNA3。以此作为检 测的起始材料(图5(a))。如(b)所示，将其分成第1阶段的简易检测A用和第2阶段的精密检测B用，如(c)所示，将各部分保存于同一装置上的不同位置 (A)和(B)。从其中，在分开放置于(A)中第l阶段的简易检测A用的样本DNA3 中加入限制性酶进行切割。其结果是，如(d)所示，样本DNA3被切分成被 切断的长DNA片段16,被切断的中等程度的长度DNA片段17，和被切断的 短DNA片段18。接着，如(e)所示，将含有这些DNA片段的溶液上样于电泳 凝胶19后，采用电泳装置20进行电泳，在凝胶上分离3种DNA片段。用可 以染色核酸的色素染色凝胶，如果可以获得所预想的电泳模式，判断在样 本DNA3中存在目的碱基序列部分4。如果该检测结果中存在问题，如下所 述，进行第2阶段的检测B。
由于第1阶段的PCR — RFLP检测中使用的样本DNA3,在检测时被切 分成被切断的长DNA片段16，被切断的中等程度长度的DNA片段17和被切 断的短DNA片段18，因此即使回收这些片段，也无法进行第2阶段的精密 检测即读取DNA的碱基序列。于是，通过使用(c)中预先分开保存于(B)的 第2阶段的精密检测B用的样本DNA(f)，通过公知的方法(例如，参照前述 Sambrook J等人的文献)，进行第2阶段的精密检测B - DNA碱基序列的读 取，检测样本DNA3目的碱基序列部分4的碱基序列15的存在(g)。
根据以上内容，简单且便宜地进行第1阶段的检测A,如果结果中存在 问题，通过使用预先分别保存于同一装置上的样本DNA，可以进行可信度 高的第2阶段的精密检测B。
并且，在回收并再次使用样本DNA时，以及，分开保存并在各检测中 使用时，第l阶段简易检测并非限于本实施方案中说明的方案。此外，如果 是可以鉴定l种或多种特定DNA的g序列的方法，可以采用任意方法。
此外，图6中例示了，使用微观流体技术进行包含于如上所述的两阶段 检测中的简易检测时的装置。在平板上，如图所示，刻入了DNA提取部21、 检测部22和DNA保存部23,它们之间通过嵌入细小的沟来连结。该装置中 仍然盖平板的盖24，盖24上，在DNA提取部的上部开有用于插入样本的孔 25。在进行简易检测时，从用于插入样本的孔25中装入样本，例如金枪鱼 块的一部分。在DNA提取部21从装入的样本中提取DNA，通过细沟使之移动到检测部22，在其中通过简易检测进行检测。由于第2阶段的精密检测而 需要分开保存的情况下，在将提取DNA的一部分输送到检测部22的同时， 通过其它的细沟使之也向DNA保存部23移动，并保存在那儿。进行简易检 测的结果是，需要精密检测时，可以将样本输送到每一个该装置进行精密 检测的场所。每一个该装置通过接收样本，进行精密检测时，如图7所示， 开着装置的盖24,回收保存于DNA保存部23和/或检测部22的DNA，用于 精密检测。通过利用这种装置，可以防止取错样本和DNA的损失，夹杂物 的混入等，可以微量进行简便的简易检测和可信度高的精密检测。
此外，本发明不限于上述的实施方式，不言而喻的是在不脱离本发明 的要点下，可以采用其它各种结构。实施例1
接着，就本发明的第一个实施例具体地说明。然而，不言而喻的是本 发明并不限于这些实施例。
按本发明的检测方法研究样本DNA的碱基序列26中是否存在图8中所 示的目的碱基序列i27。笫1阶段的简易检测即DNA杂交法中，如图8所示， 采用以荧光色素Cy5对具有与检测对象DNA的碱基序列i27完全互补的探 针碱基序列28的探针DNA进行了标记的荧光标记探针。此外，为了第2阶 段的精密检测即DNA碱基序列的读取，同样如图8所示，分别使用具有与 样本DNA的碱基序列26的 一部分完全互补的测序引物的碱基序列29的测 序引物。
按照图4的流程，首先，在50pl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl, lmM EDTA， pH 8.0)中加入用生物素修饰了具有样本DNA的碱基序列26的5，末 端的200pmolDNA和100 ja g用链亲和素包被的》兹力小珠(Bio-Adembeads Streptavidin，编号0312、 Ademtech),搅拌后，室温下放置30分钟，使磁 力小珠与DNA的5，末端结合。通过磁力微量吸液管PickPen(BIO-NOBILE) 吸引溶液中的磁力小珠来回收，通过在装入其它管中的50pl TE緩沖液中 使磁力小珠游离，并搅拌，进行磁力小珠和与之结合的DNA清洗。重复3 次这种清洗除去未反应的DNA后，悬浮于装入其它管中的50 ja 1TE緩冲液,制备出结合了小珠的DNA悬浮液(图4(b))。
接着，在50 u l结合了小珠的DNA的悬浮液中加入100pmol具有探针碱 基序列28的5，末端经荧光色素Cy5标记的探针DNA的2 H l水溶液(图4(c))。 将该混合液于94r:保持30秒，接着于55'C保持5分钟，进行杂交(图4(d))。
杂交反应后，在室温下，通过PickPen吸引溶液中的磁力小珠来回收 (e)，通过在50lil装入其它管中的TE緩冲液中使磁力小珠游离，并搅拌， 进行磁力小珠结合的DNA和与之杂交的探针的清洗。重复3次这种清洗除 去未反应的DNA后，悬浮于装入其它的管中的50jilTE緩冲液中(图4(f))。 用FLA5000荧光图像分析仪(富士照相胶片)，在使用激发波长635nm、 R665 过滤器的条件下检测该悬浮液的荧光。通过第l阶段简易检测-杂交的荧光 检测获得的结果作为此结果。如图9中所述，该悬浮液的荧光强度比只有结 合了小珠的样本DNA6的悬浮液的荧光强度明显强。此外，该悬浮液的荧 光强度比使用阴性对照探针进行同样的杂交时的荧光强度明显强，其中所 述阴性对照探针为5，末端经Cy5标识的不具有与样本DNA互补的碱基序列 而与探针DNA具有相同长度的阴性对照探针碱基序列30。此结果表明，通 过采用具有探针碱基序列28的探针DNA9的杂交反应，可以检测样本DNA 的碱基序列26中含有检测对象的碱基序列i27。
接着，于94。C加热悬浮液2分钟后，冰冷5分钟，使双链解离(图4(g))。 然后，用PickPen吸引溶液中的磁力小珠来回收，在装入其它管中的50"1 蒸馏水中使磁力小珠游离搅拌，进行结合了小珠的样本DNA6的清洗。重 复3次这种清洗除去解离的探针DNA。
使用回收的结合了小珠的样本DNA6和具有测序引物的碱基序列29的 测序引物，以及ABI公司制的BigDye Terminator vl.l Cycle sequencing Kit,按照试剂盒的说明进行测序反应，使用ABI PRISMR 310 Genetic Analyzer,进行样本DNA6的测序。
其结果如图10所示，获得的碱基序列一部分中检测到目的碱基序列 i27，通过回收简易检测中所用的样本DNA3而用于精密检测中的方法，可 以检测出目的g序列。根据以上内容，通过本实施例，为了检测特异性DNA^序列，通过 杂交法进行简易检测后，回收检测中使用的样本DNA，使用这些样本DNA， 进行作为精密检测的DNA碱基序列的读取，可以简《更且可信度高地进行检 测。
实施例2
接着，对本发明的第二个实施例具体地进行说明。不过，不言而喻的 是，本发明不限定于这些实施例。
研究本发明的检测方法是否可以定量检测样本DNA的碱基序列26中 存在图ll中所示目的^序列ii31的相对量。分别使用实时PCR法作为第1 阶段的筒易检测，使用DNAg序列的读取作为第二阶段的简易检测。实 时PCR法虽然是不使前述样本DNA破损的检测法，但是由于为用极少量的 样本DNA进行的检测，因此检测后不回收样本DNA,预先将样本DNA分成 两份，在第一阶段的实时PCR中使用其中一份，另一份在第二阶段的碱基 序列的读取中使用。
实时PCR中，如图ll所示，使用具有与检测对象DNA的碱基序列ii31 的5，末端完全同源的碱基序列32的RT引物〔1〕和具有与检测对象DNA 的4^序列ii31的3，末端完全互补的碱基序列33的RT引物〔2〕的引物对。 此外，第2阶段的精密检测DNA碱基序列的读取中，同样如图ll所示，使 用具有比与样本DNA的g序列26的3，末端完全互补的RT引物〔2〕的碱 基序列33少5个碱基的测序《)物的碱基序列29的测序引物。
首先，按照图5，将具有样本DNA的g序列26且5，末端经生物素修饰 的DNA浓度为100 n M的溶液分成两份(图5(b))，将它们分别注入连在一起 的8支PCR用管(Optical Tubes (8 Tubes/Strip)、编号4316567、 ABI)的各个 管(A)和(B)中，用盖(ABI PRISM OpticalCap, 8 caps/strips(Flat)、编号 4323032、 ABI)密封保存(图5(c))。
从其中的管(A)中每次2yl，分三次取，用蒸馏水分别将它们稀释，制 成2pM、 20fM和0.2fM的溶液。在这些各个溶液各2 p 1 (分别含有4afmo1、 40zmo1、 400ymol的样本DNA)中，分别混合5 y 110xEX Taq緩冲液(TakaraEXTaq添付品、编号RR001A、 takarabio)、 4 |a 12.5mM dNTP mix(Takara EX Taq添付品、编号RR001A、 takarabio)、 10liM的RT引物〔1〕和RT 引物〔2〕各l pl(各10pmo1)， 1.25unit Taq聚合酶(Takara ExTaq、编号 RR001A、 takarabio)、和5 ja 1SYBR Green 1(编号F0512、 takarabio)3,500 倍稀释液，分别制成50jil的水溶液。将它们分别注入96孔的微量滴定板 (Micro Amp Optical 96-well Reaction Plate、编号N801-0560、 ABI)中，用 盖(ABIPRISMOpticalCap,8caps/strips(Flat)、编号4323032、 ABI)密封。 采用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(ABI)，在95。C保持2分钟 后，重复40次95。C保持15秒和60'C保持1分钟的2个步骤，进行PCR^应， 期间，通过测定SYBR Green I的荧光强度，监控DNA的扩增。将测定结果 制成图，结果，如图12所示，越是样本DNA的浓度高者，PCR产物的量以 越小的循环数开始增加，以越小的循环数达到平稳状态。由于在使用与样 本DNA无互补性的RT引物的阴性对照实验中，没有发现PCR产物的显著 的扩增，可以确认使用RT引物〔1〕和〔2〕的扩增是特异性的。并且，反 应终止后、95。C保持15秒，接着60'C保持1分钟，此后花费20分钟使温度上 升到95。C，进行融解曲线分析。其结果是，根据图13中所示的相对荧光值 的负的一次樣i分曲线，表明扩增的DNA均为具有相同Tm值的一类序列。 在使用与样本DNA无互补性的RT引物的阴性对照实验中，融解曲线成为无 温度依赖性的基底水平的直线，由于没有观察到PCR产物，这里可以确认 釆用RT引物〔1〕和〔2〕的扩增是特异性的。进而，以图12为基础制成的 校正曲线，如图14所示，样本DNA量的对数值与Ct值成直线关系。因此， 确认样本中含有目的碱基序列ii26,进而表明采用实时PCR法可以定量检 测其量。并且，使用实时PCR法当然也可以与定量检测同样进行定性的检 测。
接着，如上所述，使用2pmol预先分注于管(B)中的具有样本DNA的碱 基序列2 6的样本DNA ，具有测序引物的碱基序列29的测序引物和ABI公司 制的BigDye Terminator vl.l Cycle sequencing Kit(编号4337449、 ABI),按 照试剂盒的说明进行测序反应，使用ABI PRISMR 310 Genetic Analyzer进行样本DNA的测序。
其结果，如图15所示，获得的碱基序列的一部分中可以检测出与目的 g序列i31完全互补的g序列34，显示出可以检测目的碱基序列。
目的g序列存在多种种类时，在一个反应槽内对多种种类的目的碱 基序列同时进行实时PCR^应，通过判断是否检测出DNA的扩增，判断目 的^序列的有无。检测出任一目的g序列的扩增时，进行第2阶段的精 密检测，鉴定存在的目的碱基序列的种类。此时，简易检测中，进行用于
以是l种，也可以是多种。
本说明书包含本申请的优先权基础-日本专利申请(特愿2006-072581 号)的说明书和/或附图中记载的内容。此外，本发明中引用的所有出版物、 专利和专利申请，照原样引入本说明书作为参考。
权利要求
1、核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有目的序列的方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易检测，判定为含有或不含有目的序列时，对同一样本核酸进行精密检测。
2、 核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有规定量或规 定量以上的目的序列的方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易的定量 检测，判定为含有规定量或规定量以上的目的序列时，对同一样本核酸进 行精密检测。
3、 根据权利要求1或2中记载的核酸的检测方法，其特征在于所述 精密检测是读取样本核酸的M序列的检测。
4、 根据权利要求1-3任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于 回收通过简易检测判定为含有或不含目的序列的核酸，或者回收通过简易 检测判定为含有规定量或规定量以上的目的序列的核酸，对该核酸进行精 密检测。
5、 根据权利要求4中记栽的核酸的检测方法，其特征在于预先对样 本核酸添加标记，在简易检测结束后，利用标记回收样本核酸。
6、 根据权利要求4中记载的核酸的检测方法，其特征在于在筒易检 测结束后，利用样本核酸与其它物质的物理化学的差异的方法回收才羊本核 酸。
7、 根据权利要求1-6任一项中记栽的核酸的检测方法，其特征在于 简易检测是不使样本核酸破损的检测。
8、 根据权利要求1-6任一项中记栽的核酸的检测方法，其特征在于 简易检测是可以保持读取样本核酸的威基序列状态的检测。
9、 根据权利要求1或2中记载的核酸的检测方法，其特征在于将样 本核酸分成两份， 一份作为筒易检测的样本核酸，另一份作为精密检测的 样本核酸。
10、 根据权利要求l-9任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在于目的序列是生物种类中特异性存在的序列。
11、 根据权利要求l-9任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在 于目的序列是基因重组体中特异性存在的序列。
12、 根据权利要求1-9任一项中记载的核酸的检测方法，其特征在 于可以用 一次简易检测同时检测多种目的序列。
全文摘要
提供了核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有目的序列的方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易检测，在判定为含有或不含有目的序列时，对同一样本核酸进行精密检测，以及提供了核酸的检测方法，该方法是检测样本核酸中是否含有规定量或规定量以上的目的序列的方法，其特征在于最初对样本核酸进行简易的定量检测，在判定为含有规定量或规定量以上的目的序列时，对同一样本核酸进行精密检测。该方法使比现有技术可信度高得多的对个体、种、生存地方等的检测成为可能。
文档编号C12Q1/68GK101528944SQ200680000720
公开日2009年9月9日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年3月16日
发明者奈须永典, 小林敬典, 辻本敦美 申请人:日本软件开发株式会社;五十岚孝雄;奈须永典