细胞电生理传感器及其制造方法

专利名称：细胞电生理传感器及其制造方法
技术领域：
本发明涉及用以测量诸如胞内电位或胞外电位的细胞电生理现象的细胞电生理传感器，以检测细胞活动中的物理化学变化，本发明还涉及制造传感器的方法。
背景技术：
已知在电生理学中的膜片钳方法被奉为用以测量细胞膜中的离子通道活动的“金标准”方法。离子通道在生理学和病理生理学中具有至关紧要的作用并且是重要的药品靶标。膜片钳在研究离子通道功能中很快成为“金标准”，但是仍然处于试验室阶段，需要在高放大率的视觉放大、振动撒布(vibration dumping)和有经验和技巧的试验员的条件下进行精确的显微操纵，因此被判断为不利于大处理量记录。在最近的发展中，对于膜片钳的微观结构芯片的应用取得进展，普通的膜片移液管(patch pipette)由微型制造芯片所取代使得通过自吸引规程(automated suction protocol)确保细胞的定位和密封。
使用处理技术的平面探测器被提出。该探测器用于自动系统，不需要插入微移液管到细胞中。
日本特开2003-527581号专利公开了在介质中电测量对象的设备。在该设备中，对象封住孔，从而设置彼此电绝缘的第一和第二穴。然后，设备分别基于位于第一和第二穴的电极之间的阻抗电检测介质中的对象。
国际申请公开第WO02/055653号专利中公开了通过细胞电生理传感器检测胞外电位的技术，所述的细胞电生理传感器包括设置于带有细胞夹持器的基板中设置的孔，测量各孔处的电子信号的测量电极以及参考电极。
“微全分析系统2004”，pp.521～522，T，Sordel et al(2004)公开了紧密容纳人工培养的细胞HEK293细胞于SiO2制得的层中的直径为2.5μm的孔中，并用以检测胞外电位的技术。
设置于平面基板的通孔用作玻璃移液管的尖端开口。该孔使得细胞电生理现象得以精确的记录，而细胞被自动的牵引并容易被来自基板的后表面的吸引力容纳。对于小背景噪音下的细胞检测很重要的是细胞被可靠的容纳在设备的平面基板中。
但是，上述现有技术均没有描述影响细胞容纳特性的平面基板最适宜的结构，诸如其形状及其表面条件。

发明内容
细胞电生理传感器包括具有第一表面和与第一表面相反的第二表面的隔板的传感器芯片，设置于隔板的第一表面上的第一区域和设置于隔板的第二表面上的第二区域。隔板具有设置于其上的通孔，通孔具有朝向第一表面开口的第一开口部，朝向第二表面开口的第二开口部和壁。第一区域接触通孔的第一开口部。设置第一区域以容纳细胞悬浊液。第二区域接触通孔的第二开口部。隔板的第一表面的碳原子比率不大于隔板的第一表面的组成的15原子百分比。
细胞电生理传感器使得细胞被紧密地容纳在隔板中的通孔的第一开口部，从而高效的检测细胞电位。


图1所示为本发明实施例的细胞电生理传感器的分解透视图。
图2所示为该实施例的细胞电生理传感器的从上面看的视图。
图3所示为图2中所示的细胞电生理传感器的沿线3-3的截面图。
图4所示为该实施例的细胞电生理传感器的放大的截面图。
图5所示为该实施例的细胞电生理传感器的放大的截面图。
图6所示为该实施例的细胞电生理传感器的放大的截面图。
图7说明该实施例的细胞电生理传感器的隔板的亲水性。
图8为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
图9为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
图10为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
图11为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
图12所示为该实施例的细胞电生理传感器的评估结果。
图13为表示该实施例的细胞电生理传感器的评估结果的表。
图14为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
图15为用以说明该实施例的传感器的制造方法的细胞电生理传感器的截面图。
具体实施例方式
图1为本发明一个实施例的细胞电生理传感器101的分解透视图。图2为细胞电生理传感器101的从上面看的视图(upper view)。图3为图2所示的细胞电生理传感器101沿线3-3的截面图。图4为图3所示的细胞电生理传感器101的A1部分的放大的截面图。图5为细胞电生理传感器101的放大的截面图。图6为图5所示的细胞电生理传感器101的A2部分的放大的截面图。细胞电生理传感器101包括传感器芯片9，内置传感器芯片9的芯片板3，孔板(well plate)6和通道板(passage plate)7。孔板6和通道板7分别接触芯片板3的上表面3A和下表面3B。如图4所示，传感器芯片9包括由诸如硅板等刚性材料制得的、具有诸如二氧化硅的绝缘材料的绝缘层1A的隔板(partition board)1，以及安装于隔板1的外部边缘的框架2。芯片板3具有通孔5在其中，所述的通孔5在上表面3A和下表面3B之间延伸。传感器9通过粘合剂16无间隙地插入各通孔5中。
隔板1如果由硅基板制得，可以在其上表面具有绝缘层1A。隔板1如果由诸如玻璃或硅土等绝缘材料制得，就不需要绝缘层1A。
孔板6具有孔6A在其中，所述的孔6A分别与隔板1中的通孔5相通(communicate)。通道板7具有设置于板7的上表面7A中的通道14以允许培养液流过。通道板7的上表面7A接触芯片板3的下表面3B，从而允许其通道14与通孔5分别相通。该设置在细胞电生理传感器101中限定通过隔板1分割的区域17A和17B。区域17A在隔板1的上表面111A和孔6A之间延伸。隔板1、芯片板3和孔6A用作形成区域17A的组件。区域17B在隔板1的下表面111B和通道14之间延伸。隔板1，芯片板3和通道板7用作形成区域17B的组件。区域17A和17B可以容纳各种彼此不同的溶液。区域17A接触设置于隔板1的通孔4的开口部4A，而区域17B接触通孔4的开口部4B。
由金属性材料如铂、金、银，或氯等制得的电极15安装在芯片板3的上表面3A以及通孔5的周围。
隔板1之中具有通孔4，其使得区域17A和17B彼此相通，并分别具有朝向区域17A和17B开口的开口部4A和4B。如图5和6所示，区域17A容纳包含细胞8的溶液，即细胞悬浊液。当通过通孔4从区域17B吸取溶液时，细胞8朝向通孔4的开口部4A移动并且之后容纳在开口部4A。通孔4的尺寸取决于小于细胞8的尺寸。
细胞8通过从区域17B吸入而容纳在区域17A中。此时，细胞8在通孔4的开口部4A处变形，并且细胞膜的一部分接触通孔4的壁4C以及隔板1的上表面111A，如图6所示。在细胞电生理传感器101中，通孔4的壁4C和隔板1的上表面111A由诸如二氧化硅的绝缘材料制成的绝缘层1A覆盖。在细胞接触表面，即与细胞8接触的隔板1的壁4C和上表面111A中的碳原子比率(atomic ratio of carbon)设为小于表面组成的15原子百分比(atomic percent)。根据该实施例，碳原子比率通过X射线光电子光谱(XPS)技术测量。XPS技术涉及能量和光电子数量的检测以明确原子的数量和表面上及表面附近原子所处的环境，并从而检测原子的化学键接。具体而言，原子的名称、数量及化学状态通过将隔板1的表面暴露于X射线并且检测X射线激发的光电子进行检测。根据本实施例，X射线的光点直径(spotdiameter)设为100μm左右。当隔板1的表面垂直地暴露于与表面垂直的X射线时，从与表面的45度角检测光电子。可以检测到位于约距表面20nm深处的各原子。即，原子或分子在接触表面的数量为从表面至20nm深度存在的原子的数量。
根据本实施例，测量作为细胞电生理现象的细胞电位，但是并不限于此。其他细胞电生理现象，诸如细胞膜上流过的膜电流，膜电阻以及膜电容也通常被检测以检测离子通道的特性。
由于细胞膜的外表面为不同的碳水化合物、蛋白质和类脂物的复合混合物，其中存在大量的羟基，所以在制造传感器期间不同的离子和原子粘附在传感器的表面。其中许多有机化合物阻止细胞膜和传感器表面之间的氢键形成。因此，从隔板1的表面减少有机化合物并在表面产生OH基团可以显著地增加细胞膜和传感器表面之间的相互作用，因此允许准确并快速地检测细胞电位。
控制隔板1的亲水性可以有效地增加隔板1的表面对于培养液，胞外溶液或胞内溶液的亲和力。图7所示为隔板1的亲水性。重蒸馏水(doubledistilled water)的水滴51设置在隔板1的表面上。表面上的水滴51的接触角D1优选不大于10度。该条件为必要但不充分的。
在细胞电生理传感器101中，在隔板1的表面中的碳原子比率减少，并且产生活性羟基以增加细胞膜和表面之间的氢键，从而防止电流在区域17A和17B之间泄漏。这使得可在小的背景噪音下检测细胞电位。隔板1的接触细胞8的细胞接触表面，上表面111A，具有亲水性，允许培养液、胞外溶液或胞内溶液以及细胞8容易地流入到通孔4。随着溶液从区域17B吸取并流入区域17B，细胞8容纳在通孔4的开口部4A处和表面111A上，并且细胞电位容易地测量。通孔4的内壁4C的亲水性以及隔板1的下表面111B以及隔板1的上表面111A的亲水性优选地增大。
隔板1的通孔4的壁4C的亲水性越大，上述效应更加明显。
从细胞接触表面，隔板1的上表面111A移除有机化合物，以获得碳原子比率不大于表面组成的15原子百分比的方法，以及在细胞电生理传感器101中增大上表面111A，下表面111B和隔板1的通孔4的内壁4C的亲水性的方法在下面详细说明。
首先，说明制造细胞电生理传感器101的方法。
图8到15为用以说明制造传感器的方法的细胞电生理传感器101的截面图。
首先如图8所示，制备积层基板61，其包括硅基板10，在硅基板10上的二氧化硅层11，以及在二氧化硅层11上的薄硅层12。
然后，如图9所示，使用光刻(photo-lithography)工艺以在薄硅层12和二氧化硅层11中均设置通孔4。
然后，如图10所示，在薄硅层12中的通孔4的上表面12A和壁4C上设置二氧化硅层18。二氧化硅层18具有不小于0.3μm的厚度，优选地不小于0.5μm的厚度。二氧化硅层18优选地可以由基板61在氧氛围中加热到不低于1100℃的温度的热氧化工艺(thermal oxidation process)，在真空条件下沉积具有微粒(fine particle)的层的喷镀工艺或化学气相沉积(CVD)工艺三者中任一进行沉积。热氧化工艺使得二氧化硅层18均匀地沉积在通孔4的壁4C，以及薄硅层12的上表面12A上。虽然喷镀工艺以及CVD工艺使得薄硅层12的通孔4的壁4C上的二氧化硅层18比薄硅层12的上表面12A上的二氧化硅层18薄，但是提供二氧化硅层18的光滑表面，使得比由热氧化工艺提供的层具有亲水性。
然后，如图11所示，光刻工艺用于在硅基板10中提供穴13，其从上表面10A延伸到二氧化硅层11，从而提供包括具有通孔4的隔板1和框架2的传感器9。具体而言，二氧化硅层11以及薄硅层12用作隔板1，而具有穴13的硅基板10用作框架2。
包括有机化合物和空气中飘浮物(float)的粒子通常吸收在通过以上工艺提供的传感器芯片9的隔板1的上表面111A上，下表面111B上以及通孔4的壁4C上，并且使隔板1的上表面111A和下表面111B疏水(hydrophobic)。
然后对于经由图8到11所示的工艺制造的传感器芯片9执行下述工艺以从隔板1的上表面111A、下表面111B和壁4C，即细胞接触表面除去这些有机化合物。隔板的表面中的碳原子比率不应大于隔板的表面组成的15原子百分比。金属和离子可以保留，因为他们可以增加表面的亲水性。水接触角度D1(见图7)应该不大于10度以保持表面的亲水性。
加入氧化剂到具有控制在80℃到250℃之间的温度的浓硫酸中，从而提供硫酸溶液，即氧化溶液。氧化剂可以优选为过硫酸铵(NH4)2S2O8，硝酸HNO3，和臭氧O3中选出的一种。过硫酸铵、硝酸和臭氧分别以固体、液体和气体形式供给，从而通过合适的设备加入到浓硫酸中。
下述反应在过硫酸铵和浓硫酸之间发生并产生H2S2O3H2SO4+(NH4)2S2O8→(NH4)SO4+H2S2O8。
当传感器芯片9浸入氧化溶液中，包括隔板1的上表面111A、下表面111B和壁4C的传感器芯片9的表面上附着的有机化合物与H2S2O8发生如下反应H2S2O8+(CHO)X→XCO2+XH2O+H2SO4其中，(CHO)X为具有长度X的CH基团。该反应分解传感器芯片9的表面的有机化合物。
在上述反应中，作为氧化剂的过硫酸铵产生作为副产物的硫酸H2SO4。在浓硫酸和作为氧化剂的过硫酸铵之间的反应通过CH基团和H2S2O8的反应而不断地发生，从而产生硫酸作为最后的产物。该反应降低了小于反应产物量的量的硫酸的分解和消耗，因此可以防止硫酸溶液的劣化并提供稳定的传感器芯片9。
然后，浸入氧化溶液中的传感器芯片9用重蒸馏水洗涤以除去残留的氧化溶液，然后保存于重蒸馏水中。
在浸入到氧化溶液后，传感器芯片9可以浸入到氢氧化铵溶液中。氢氧化铵溶液蚀刻隔板1的表面处的二氧化硅层11和18的表面。蚀刻进一步有效地从隔板1的表面除去有机化合物。该蚀刻提高隔板1的表面的光滑度，从而进一步提供亲水性。隔板1可以优选涂上二氧化硅或包含二氧化硅的材料。在用氢氧化铵溶液蚀刻的过程中，二氧化硅具有小蚀刻速度，从而保护隔板1不被过度蚀刻。如果硅暴露于隔板1的表面，通过氢氧化铵溶液控制硅以防止过度蚀刻。如果隔板1被过度蚀刻，那么表面具有小的光滑度，从而具有较小亲水性。氢氧化铵溶液可以用碱水溶液代替，所述碱水溶液包含铵、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的至少一种。
有机化合物通过上述工艺从表面上除去，然后，传感器芯片9使用重蒸馏水洗涤并保存于重蒸馏水中。
在浸入到氧化溶液中前，传感器芯片9可以浸入到氯仿和甲醇的混合物中。该工艺可有效从传感器芯片9的表面除去可溶于有机溶剂的化合物，并使得后续的工艺高效地执行。在浸入到氯仿和甲醇的混合物后，传感器芯片9可以优选用重蒸馏水洗涤。使用重蒸馏水洗涤后，传感器芯片9浸入到氧化溶液中。
上述工艺的除去有机化合物以及增加表面亲水性的效果表示在图12和13中。样品S1、S2和S3为传感器芯片9并均以同样方法制造。样片S1不用氧化溶液处理。样品S2用氧化溶液处理并用重蒸馏水洗涤。样品S3用氧化溶液处理，用重蒸馏水洗涤并用氢氧化铵溶液蚀刻。图12显示样品S1、S2和S3的XPS光谱，其显示各样品的表面上的元素的量。
图13为总结表面中发现的前三大元素，即，碳、氧和硅的原子比率，以及各样品表面的水接触角度D1的表(见图7)。水接触角度D1显示样品表面的亲水性。
在样品S1中，表面组成的18原子百分比为碳，并且接触角D1为49.5度。样品S1不能足够紧密地在隔板1的细胞接触表面，上表面111A上容纳细胞8。
在样品S2中，表面组成的14原子百分比为碳，并且其水接触角D1为7.8度，表明其亲水性比样品S1的大很多。亲水性越大，在表面上牵引水的力(表面张力)越大。这允许溶液容易地流入到通孔4，并且细胞8因此强烈地吸入到通孔4的开口部4A。虽然没有直接测量隔板1的通孔4的壁4C的水接触角，但是由氧化溶液可以容易地流入到通孔4中的事实表明亲水性的提高。在样品S3中，只有表面组成的9原子百分比为碳并且其水接触角D1为3.1度，显示其亲水性比样品S1和S2的都大。
保存于重蒸馏水中的传感器芯片9经过表面处理后从水中取出，并且将芯片表面一部分干燥，然后插入到芯片板3的通孔5中，如图14所示。
然后，如图15所示，涂覆粘合剂16在通孔5中传感器芯片9的部分，以通过粘合剂16填充通孔5中传感器芯片9和芯片板3之间的间隙。粘合剂16可以优选地为容易处理的可紫外线固化型。可紫外线固化粘合剂不需要可热固化粘合剂所需要的加热工序，并可以在短时间内硬化。因此，隔板1，特别是通孔4周围的区域，不暴露于空气很长时间，因此不会减小其亲水性。
在粘合剂16固化后，安装有传感器芯片9的芯片板3放置并密封在充有水或水蒸气的容器中以保存芯片板3。
在隔板1的细胞接触表面，上表面111A、下表面111B和通孔4的壁4C暴露于水或水蒸气的同时，上述工艺可以将板保存到其使用时。该操作使得细胞8以较小电流泄漏紧密地封入通孔4，从而使得细胞电位可以被高效地测量。
如上所达，根据实施例所述的细胞电生理传感器101在隔板1中通孔4的开口部4A处紧密地容纳细胞8，并且以很小的电流泄漏检测细胞电位。因此，细胞电生理传感器101可以用于筛分设备(screening device)以检测细胞8的化学效应和筛分化学物质。
工业适用性根据本发明的细胞电生理传感器使得细胞可以被紧密地容纳，因此可以用于高效地测量细胞电位的设备中。
权利要求
1.一种细胞电生理传感器包括具有隔板的传感器芯片，所述隔板具有第一表面和与所述隔板的所述第一表面相反的第二表面，所述隔板其上设置有通孔，所述通孔具有第一开口部，第二开口部和壁，所述通孔的所述第一开口部朝向所述隔板的所述第一表面开口，所述通孔的所述第二开口部朝向所述隔板的所述第二表面开口；设置于所述隔板的所述第一表面上的第一区域，所述第一区域接触所述通孔的所述第一开口部，设置所述第一区域以容纳细胞悬浊液；以及设置于所述隔板的所述第二表面上的第二区域，所述第二区域接触所述通孔的所述第二开口部，其中所述隔板的所述第一表面的碳原子比率不大于所述隔板的所述第一表面的组成的15原子百分比。
2.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板的所述通孔的所述壁的碳原子比率不大于所述壁的组成的15原子百分比。
3.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板的所述第二表面的碳原子比率不大于所述第二表面的组成的15原子百分比。
4.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板的所述第一表面上水滴的接触角不大于10度。
5.根据权利要求4所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板的所述通孔的所述壁上水滴的接触角不大于10度。
6.根据权利要求4所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板的所述第二表面上水滴的接触角不大于10度。
7.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板包括在其所述第一表面处的二氧化硅层。
8.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板包括在其所述第二表面处的二氧化硅层。
9.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中所述隔板包括在所述通孔的所述壁处的二氧化硅层。
10.根据权利要求1所述的细胞电生理传感器，其中当所述隔板的所述第一表面，所述第二表面和所述通孔充满水时，保存所述传感器芯片。
11.一种制造细胞电生理传感器的方法，包括在传感器芯片的隔板中设置通孔，所述隔板具有第一表面和与所述隔板的所述第一表面相反的第二表面，所述通孔具有第一开口部，第二开口部和壁，所述通孔的所述第一开口部朝向所述隔板的所述第一表面开口，所述通孔的所述第二开口部朝向所述隔板的所述第二表面开口；将所述传感器芯片浸入氧化溶液中；在所述氧化溶液中浸入所述传感器芯片后，用水洗涤所述传感器芯片；形成设置在所述隔板的所述第一表面上的第一区域，其在所述隔板中与所述通孔的所述第一开口部接触，设置所述第一区域以容纳细胞悬浊液；以及形成设置在所述隔板的所述第二表面上的第二区域，其在所述隔板中与所述通孔的所述第二开口部接触。
12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括加热所述氧化溶液，其中所述的将所述传感器芯片浸入氧化溶液中包括在所述加热的氧化溶液中浸入所述传感器芯片。
13.根据权利要求11所述的方法，进一步包括暴露所述传感器芯片的所述隔板的所述第一表面于氯仿和甲醇的混合液体；并且在所述暴露所述传感器芯片的所述隔板的所述第一表面于所述氯仿和甲醇的混合溶液后，通过用水洗涤所述第一表面除去所述传感器芯片的所述隔板的所述第一表面的所述氯仿和甲醇混合液。
14.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在所述用水洗涤所述传感器芯片的步骤后，用碱性溶液蚀刻所述隔板的所述第一表面。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述碱性溶液包括氢氧化铵，铵，氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化锂之一。
16.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在所述隔板中设置通孔后，在所述第二表面上和所述隔板的所述通孔的所述壁上设置二氧化硅层。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述设置所述二氧化硅层包括通过热氧化方法、喷镀方法和化学气相沉积方法之一设置所述二氧化硅层。
18.根据权利要求11所述的方法，进一步包括设置其中具有通孔的板；在所述用水洗涤所述传感器芯片后，在水中保存所述传感器芯片；从所述水中取出所述保存的传感器芯片；干燥所述传感器芯片的部分并且之后将所述传感器芯片插入所述板中的所述通孔中；对于所述板的所述通孔中的传感器芯片的所述干燥的部分涂覆粘合剂；硬化所涂覆的粘合剂；并且在充满水或水蒸气的氛围中保存在所述板的所述通孔中具有所述传感器芯片的板。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述氧化溶液包括含有浓硫酸和氧化剂的硫酸溶液。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述氧化剂为过硫酸铵、硝酸和臭氧之一。
全文摘要
细胞电生理传感器包括具有含第一表面和与第一表面相反的第二表面的隔板的传感器芯片，用以形成设置于隔板的第一表面上的第一区域的组件，以及用以形成设置于隔板的第二表面上的第二区域的组件。隔板上设置有通孔，通孔具有朝向第一表面开口的第一开口部，朝向第二表面开口的第二开口部和壁。第一区域接触通孔的第一开口部。第一区域设置以容纳细胞悬浊液。隔板的第一表面的碳原子比率不大于第一表面的组成的15原子百分比。细胞电生理传感器使得细胞紧密地容纳在隔板中的通孔的第一开口部中，从而高效的检测细胞的电位。
文档编号C12M1/34GK101080635SQ200680000629
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月22日 优先权日2005年11月14日
发明者中谷将也, 牛尾浩司, 平冈聪一郎, 阿卜杜拉·梅尼克 申请人:松下电器产业株式会社