专利名称：反义寡核苷酸的制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物，具体地说涉及反义寡核酸药物的制备及防治流感病毒的用途。
流感病毒是呼吸道感染的主要病原。由于流感病毒变异，常规疫苗如灭活疫苗和弱毒活疫苗不能有效预防流感发生与流行。目前唯一投入临床应用的治疗流感药物金刚胺类具有神经毒性副作用、易导致耐药毒株出现等缺陷，因此研究特异性高、毒性作用小的新型流感药物对流感治疗与预防有重要现实意义(Nicholson et a1.Seminars in Respiratory Infection 1992,7(1):26-37；Kimberlin et al.Antiviral Res.1995,26(4):369)。反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide,ASON)是一类能与DNA/RNA结合并特异性阻断基因表达的合成DNA片断，是治疗病毒性传染病和肿瘤的潜在新型药物(Stein et al.Science 1993,262(20):1004-1012)。国外已尝试利用反义寡核苷酸抑制流感病毒复制。1987年Zerial等筛选到能抑制A型流感病毒复制的由7个核苷酸组成的ODN(zerial et al.Nucleic Acids Res.1987,15(23):9909-9919)，但作为药用的特异性需进一步研究。也有报道以A型流感病毒PA、PB1、PB2、NP等基因为靶点筛选到抗特定流感病毒毒株的ODN(kabanov et al.FEBS Letters 1990,259(2):327-330；Leiter et al.PNAS 1990,87(9):3430-3434；Hata et al.Biochem Biophys Res Commun 1996,223(2):341-346；1997,232(2):545-549)，考虑到作用靶点序列保守程度，这些ODN抗A型流感病毒的广谱性有待进一步证实。
本发明的目的是根据流感病毒基因组设计并制备两条寡核苷酸，以此可作为流感病毒感染的治疗药物。
本发明的主要内容是，以A型流感病毒基因组各个片断5’端(5’AGUAGAAACAAGG3’)和3’端(5’CCUGCUUUU/CGCU3’)保守序列为靶点，设计并合成与5’端互补的ODNIV4#(5’CCTTGTTTCTACT3’)和与3’端互补的ODNIV3#(5’AGCI*AAAGCAGG3’)，以A型流感病毒代表株A1/京防/86-1(H1N1)和A3/鲁防/93-9(H3N2)为对象，以流感病毒血凝(HA)滴度和致细胞病变作用(CPE)为指标，在MDCK细胞系中评价了IV4#和IV3#抑制流感病毒复制特性，结果表明，IV3#和IV4#能特异性抑制流感病毒复制。例如，当IV4#浓度为1μmol/L时对病毒抑制率近50％；浓度为10μmol/L或更高时对病毒复制抑制率超过70％。而且，ODN抑制病毒活性呈序列和剂量依赖性。在流感病毒感染小鼠模型中，IV4#和IV3#能有效抑制流感病毒感染引起的肺病变，并降低肺中病毒滴度。总之，根据本发明，与A型流感病毒基因组5’端和3’端保守序列互补结合的寡核苷酸IV3#和IV4#能特异性抑制流感病毒复制，是一种应用于治疗和预防流感病毒感染的新型生物工程药物。
关于寡核苷酸IV3#和IV4#的长度，本发明公开了IV3#长度为12个核苷酸，IV4#长度为13个核苷酸。反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性、与靶序列结合亲和性、作用特异性等因素相关。IV3#和IV4#的最短长度需根据实验确定，本发明包含了与IV3#和IV4#具有相同序列的任何长度寡核苷酸。
抑制流感病毒的反义寡核苷酸可以通过修饰来增加其稳定性。组成寡核苷酸的磷酸酯基团可以在天然磷酸二酯键部分的自由单键氧位置进行修饰，其中可以是氧、甲基或硫。制备时，将固相支持物连接、保护的通过固相合成的含本发明核苷酸序列的寡核苷酸脱保护、从固相支持物切离。本发明公开的即是按该方法制备的硫代IV3#和IV4#。因此寡核苷酸的制备及其修饰方法也是本发明中的内容之一。
根据发明，用于防治流感病毒感染的反义寡核苷酸组合物，其中含有至少一种本发明的寡核苷酸或其修饰物如果适当的话，还可以含有治疗上可接受的载体材料，如脂质体、融合肽或病毒载体等。
结合
本发明的具体实施方法如下图1为IV3#ODN、IV4#ODN及其正义序列构成的ODN IV3S和IV4S对流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中复制的抑制作用。图2为IV4#ODN对流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中致细胞病变作用的抑制作用。其中，A．流感病毒感染MDCK B．流感病毒+0.1μmol/L ODN C．流感病毒+1μmol/L ODN D．流感病毒+10μmol/L ODN E．未感染病毒的正常MDCK细胞图3为IV4#ODN对流感病毒A/鲁防/93-9(H3N2)和A/山东/93-9(H3N2)在MDCK中复制的抑制作用。图4为IV4#ODN及其脂肪链修饰物IV4#R在脂质体(Lipofectin)作用下对流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中复制的抑制作用。
实施例一本实施例的技术要点如下1．MDCK细胞系和流感病毒A/京防/86-1(H1N1)、A/鲁防/93-9(H3N2)以及A/山东/93-3(H3N2):MDCK培养液为含10％小牛血清(GIBCO.BRL)的DMEM培养液，繁殖病毒和ODN筛选时使用含5g/ml胰蛋白酶的DMEM。冻干流感病毒在10日龄SPF鸡胚传代3-4次，收集尿囊液，2,000g离心10分钟，分装，-70℃保存，作为感染MDCK的病毒原液。
2．硫代寡聚脱氧核糖核酸(PS-ODN)设计与合成参考A型流感病毒基因组末端保守序列，设计四条ODN:IV3#:5’AGCI*AAAGCAGG3’；IV3S:5’CCTGCTTTIGCT3’IV4#:5’CCTTGTTTCTACT3’IV4S:5’AGTAGAAACAAGG3’。PS-ODN在Applied Biosystems 391DNA合成仪合成。合成后先用浓氨水55℃脱保护15小时，然后用反相柱(购自Solid PhaseSciences公司)层析法纯化。
3．抗流感病毒反义寡核苷酸筛选以106个细胞/孔把MDCK接种到96孔细胞培养板(Nunc)，细胞生长液为含10％小牛血清的DMEM。37℃培养过夜，用PBS(pH7.5)冲洗3次。用含0.2％BSA的DMEM把PS-ODN稀释成如下浓度0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，以50μl/孔的量加入各孔(每个稀释度4孔)，37℃作用1小时；再以PBS(pH7.5)冲洗3次，加入50μl 320x稀释的流感病毒A/京防/86-1(H1N1)(MOI=1),37℃作用45-60min；以PBS(pH7.5)冲洗3次，加入含0.2％BSA、5μg/ml胰蛋白酶和相同浓度PS-ODN的DMEM，同时设立病毒感染阳性对照和MDCK阴性对照。37℃培养2天，通过观察细胞病毒致细胞病变作用和病毒血凝滴度测定方法评定PS-ODN抑制病毒复制活性。
图1为PS-ODN IV4#、IV4S、IV3#、IV3S对流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK细胞复制的血凝滴度抑制率。从图中看出，浓度为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L时，IV4##样均有抑制病毒活性。当浓度为1μmol/L时，对病毒HA滴度抑制率近50％；当浓度为10μmol/L或更高时，对病毒复制抑制率超过70％；并且IV4#对流感病毒复制的抑制作用呈浓度依赖性。IV4S浓度为1μmol/L、5μmol/L时未表现出抑制活性，在高浓度时有轻微抑制病毒活性，如浓度为20μmol/L时抑制率不到50％。IV3#对流感病毒的作用与IV4S基本相似，但浓度为1μmol/L、5μmol/L时，IV3#表现促进病毒复制作用，如浓度为1μmol/L时，使病毒滴度升高50％。IV3S浓度为1μmol/L时不具有抑制病毒活性，浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L时只表现轻微抑制作用。另一方面，IV4#抑制病毒CPE作用，且浓度越大抑制作用愈明显(图2)。以上结果表明，IV4# PS-ODN具有抑制流感病毒在MDCK中的复制作用，而且抑制病毒活性呈序列特异性和剂量依赖性。同时，发现IV4#ODN同样抑制A/鲁防/93-9(H3N2)和A/山东/93-9(H3N2)在MDCK中复制(图3)，表明IV4#ODN能特异性抑制A型流感病毒代表株的复制。4．脂质体Lipofeetin对IV4# PS-ODN抑制病毒活性的影响96孔细胞培养板上长成70-80％单层的MDCK细胞，以PBS(pH7.5)冲洗3次，每孔加入含S-ODN(浓度分别为01μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)和0.4μl(1μg/μl)lipofectin(GIBCO.BRL)的DMEM 100μl,37℃作用4小时，接着按本实施技术要点(3)的方法评定ODN抑制病毒活性。
图4为IV4#ODN及其脂肪链修饰物在lipofectin转染条件下对流感病毒血凝滴度的抑制率、无lipofectin时，IV4#R对病毒抑制作用不如IV4#，如浓度为1μmol/L和10μmol/L时，IV4#的抑制率为56.2％和78.1％，而IV4#R的抑制率是30％和50％。在lipofectin转染条件下，IV4#和IV4#R抑制病毒活性明显增强，如浓度为0.1μmol/L、10μmol/L时抑制率分别为31.2％、75％和60％、77.5％。IV4#ODN与其脂肪链修饰物IV4#R在lipofectin转染条件下抑制病毒活性差异不明显。IV4#与IV4#R在lipofectin转染时抑制病毒活性与盐酸金刚胺作用效果相近，当浓度为0.5μmol/L和5μmol/L时盐酸金刚胺对病毒抑制率分别为79.7％和100％。实施例二本实施例的技术要点如下1．流感病毒适应小鼠过程取在11日龄SPF鸡胚传代的A/京防/86-1(H1N1)(血凝滴度为29HAU/40μl)50μl，通过滴鼻方式接种6周龄BALB/C雌鼠，饲养3天后无菌状态下取肺用PBS以Wt/V=1∶10制备肺匀浆，-20℃/37℃冻融三次，5,000rpm离心10分钟，取上清以同样方式在小鼠传代。共传代6次，最后取肺匀浆上清接种11日龄SPF鸡胚，测定HA滴度，分装，-70℃保存备用。
2．反义寡核苷酸在小鼠模型中抑制流感病毒活性评价取小鼠适应流感病毒A1M6(29HAU/40ul)50μl，通过滴鼻方式接种6周龄BALB/C雌鼠，同时按100μg/鼠的剂量以同样方式接种反义寡核苷酸IV4#，然后每天按100μg/鼠的剂量接种一次，共接种5次，停药后饲养2天，称体重，取肺并称重，以Wt/V=1∶10制备肺组织匀浆，-20℃/37℃冻融三次，在MDCK中测定病毒滴度。发现反义寡核苷酸IV4#ODN能明显阻止小鼠体重减小，接种IV4#ODN鼠肺重/体重平均值接近正常鼠，而且能明显抑制流感病毒引起的肺病变和肺中病毒滴度，说明反义寡核苷酸IV4#ODN能有效抑制鼠模型中流感病毒的复制。可应用流感病毒感染治疗。
权利要求
1．包含两条由特定核苷酸序列组成的寡核苷酸。其特征在于，一条序列为5’AGCI*AAAGCAGG3’，代号IV3#ODN，其中I*代表次黄嘌呤碱基；另一条序列为5’CCTTGTTTCTACT3’，代号IV4#ODN。
2．根据权利要求1所述的两条寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸及其修饰物具有抑制流感病毒用途；与载体如脂质体、融合肽或病毒等制成复合物也可应用于抑制流感病毒复制。
3．根据权利要求1所述的寡核苷酸，组成寡核苷酸的磷酸酯基团，其特征是该基团在天然磷酸二酯键部分的自由单键氧位置可以氧、硫或甲基。
4．根据权利要求1所述寡核苷酸的制备方法，其特征在于，制备过程为将固相支持物连接、保护的通过固相合成的含本发明核苷酸序列的寡核苷酸脱保护、从固相支持物切离。
5．根据权利要求1中所述的寡核苷酸，其特征在于，包含与IV3#ODN序列相同，长度为小于12个核苷酸组成的任何寡核苷酸；与IV4#ODN序列相同，长度为小于13个核苷酸组成的任何寡核苷酸，用于制备治疗流感病毒的药物。
全文摘要
本发明涉及一种生物工程产品及其用途,具体地说是根据流感病毒基因组设计并制备的两条反义寡核苷酸,可用于抑制流感病毒复制。本发明首次发现,针对A型流感病毒基因组3’端和5’端保守序列,3’UCGU/CUUUCGUCC5’和3’GGAACAAAGAUGA5’,设计并合成了与其互补的寡核苷酸(ODN):IV3＃ODN(5’AGCI
文档编号C07H21/00GK1219541SQ9712035
公开日1999年6月16日 申请日期1997年12月12日 优先权日1997年12月12日
发明者王升启, 陈忠斌, 朱宝珍, 孙志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所