专利名称：破伤风外毒素c片段的b细胞表位肽的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及破伤风外毒素C片段的B表位肽的应用。
技术背景 破伤风外毒素(tetanus toxin,TT)是破伤风梭菌感染伤口后，在缺氧的条件下分 泌产生的一种神经毒素，可导致患者因喉痉挛或继发严重的肺部感染而死亡，死亡率可高 达20 % 50 %。全世界每年约有5万人死于破伤风，我国的破伤风死亡率高于世界平均水 平。抗生素不能清除破伤风外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破伤风毒素的抗体 和疫苗是首选治疗药物。破伤风外毒素蛋白分子量为150kDa。毒素经菌体释放后，在蛋白水解酶的作用下， 被“裂解”成一条轻链(50kDa)和一条重链(IOOkDa)，但轻链和重链之间仍有二硫键相连。 轻链是锌依赖蛋白酶，通过水解突触囊泡蛋白_2来阻断神经抑制性介质的释放。C蛋白是 重链的一部分，分子质量为50kDa，不具备神经毒素的活性，却保留了完整毒素与神经节苷 脂结合等许多性质，是毒素的保护性抗原。C蛋白还能将小分子蛋白靶向传递到运动神经 元，所以也可作为蛋白载体促进低免疫原性抗原的免疫反应。由于C蛋白是破伤风毒素的 非毒性片段，且有较高的免疫原性，因此是制备破伤风疫苗和筛选抗破伤风中和性单克隆 抗体的一个理想靶标。鉴于以上研究背景本发明预测并合成了破伤风外毒素C片段的B细胞表位，并对 预测的B细胞表位的免疫原性和免疫保护性进行了鉴定，本发明的B细胞表位肽可用于破 伤风梭菌感染的肽疫苗研究和利用B细胞表位肽制备特异的单克隆抗体诊断、预防和治疗 破伤风梭菌的感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的应用，其 中之一为来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽在制备预防、诊断或治疗破伤风梭菌感 染的药物中的应用，其中所述破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示(其核苷酸序列分别如SEQ IDNO :5_8所示)。上述的来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽还可以用于制备抗破伤风毒素单 克隆抗体。本发明的另一目的是提供用于制备预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的药物，其 包含至少一个来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽，和药学上可接受的载体，其中所述 破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQID NO :1_4所示。所述药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。本发明还提供一种预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的疫苗，其包含至少一个来 自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽，其中所述破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:l-4所示。本发明的思路如下首先基于破伤风外毒素与配体相互作用的晶体结构，按B细 胞表位的预测原则，对破伤风外毒素C片段的氨基酸序列进行分析，预测毒素片段的B细胞 表位，并采用DNAStar软件分析评价，人工合成B表位肽，用合成的B细胞表位肽偶联载体 蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)后免疫Balb/c小鼠，检测抗体效价 鉴定其免疫原性；Western blot鉴定鼠抗血清的特异性，并以天然破伤风外毒素攻毒，鉴定 B细胞表位肽的免疫保护性，结果显示P4B细胞表位肽能刺激机体产生较强的抗破伤风外 毒素的中和抗体，该肽段位于破伤风外毒素C片段N端第312 326位氨基酸。本发明的B 表位肽可以用来研制人或小鼠用的破伤风肽疫苗，可以用来开发预防或治疗破伤风梭菌感 染的多肽药物。 本发明经过深入而广泛的研究，基于破伤风外毒素蛋白的晶体结构，辅以DNAStar 软件分析，选择性的合成了 4条可能诱导机体产生体液免疫应答的B细胞表位肽，并对其免 疫特性进行评价，发现此4条表位肽能够在Balb/c小鼠体内诱导特异性的体液免疫应答， 产生的抗血清均能与破伤风外毒素蛋白发生特异性结合。因此，此四条多肽可以用于破伤 风梭菌的多表位肽疫苗的设计；本发明的4条多肽可以用于人及动物用的疫苗及抗体药物 的开发。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1表示免疫印迹鉴定鼠抗血清的特异性，其中1表示PlB表位肽鼠抗血清的免疫印迹2表示P2B表位肽鼠抗血清的免疫印迹3表示P3B表位肽鼠抗血清的免疫印迹4表示P4B表位肽鼠抗血清的免疫印迹。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本 发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，及对 本发明表位肽及其核苷酸序列的利用都属于本发明要求保护的范围。实施例IB表位的筛选鉴定1.表位肽的预测及合成在NCBI的结构数据库检索破伤风外毒素与配体神经节苷脂晶体结构解析图 (MMDB ID 75338)，网址:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/mmdb/mmdbsrv. cgi ？ Uid = 75338)。基于Stx2与配体神经节苷脂相互作用的立体结构，依据暴露在蛋白质表面、 含伸展区和无规则卷曲或β转角、以及肽段长度约10 20个氨基酸等B表位肽的预测原 贝1J，选取破伤风外毒素毒性片段上的氨基酸肽段，采用DNAStar软件对预测的氨基酸肽段 进行亲水(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karplus-Schulz方 案)、二级结构(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等参数进行评价，如果某肽段中，抗原指数> 1、亲水性指数> O、氨基酸的表面可能性指数> 1，同时 其内部或附近又具有柔性结构，则这一区段为抗原表位的可能性较大。通过BLAST检索比 较预测的B细胞表位肽与人、兔、鼠的同源性后，最终确定本研究所用的4条可能的B细胞 表位肽序列，人工合成4条可能的B表位多肽(由北京中科亚光公司协助合成，4条B细胞 表位肽的基本信息见表1)，并分别偶联载体蛋白KLH。表1预测合成后的破伤风外毒素C片段的B表位的基本信息 (其核苷酸序列分别如SEQID NO :5_8所示)2.破伤风外毒素B细胞表位肽的鉴定2. 1 免疫 Balb/c 小鼠8周龄Balb/c小鼠，，随机分成5组，每组10只，雌雄各半，分别用偶联KLH的4条 B细胞表位肽(Pl-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)加完全福氏佐剂皮下多点注射免疫，每只 注射0. 5ml，含抗原肽100 μ g，免疫时间为0、2、4、6、8周，共5次，第1次加入福氏完全佐剂 第2 4次加福氏不完全佐剂，最后一次不加佐剂同样剂量腹腔注射免疫一次，第2、3、4、5 次免疫后7d取尾血，采用间接ELISA法检测免疫Balb/c小鼠血清效价，对照组PBS替代多 肽进行免疫，免疫方法及程序相同。2. 2ELISA检测血清效价间接ELISA的包被抗原分别为未偶联KLH的4条多肽和破伤风外毒素C片段。具 体方法如下包被用包被液将抗原稀释为2 μ g/ml，加入酶标板，100 μ 1/孔，4°C过夜，PBS洗 涤5遍，空干；封闭加BSA封闭液300 μ 1/孔，4°C过夜，洗涤5遍，空干，密封4°C保存
备用；鼠血清稀释按1 100，1 200,1 400......进行系列倍比稀释至第10管；取
包被好的酶标板，加入依次稀释血清100 μ 1/孔，37°C水浴30分钟，洗涤5遍，空干；加辣根 过氧化物酶标记的羊抗鼠gG抗体工作液(1 20000稀释)100 μ 1/孔，37°C水浴30分钟， 洗涤4遍，空干；加底物显色液100 μ 1/孔，室温避光反应5 10分钟；加终止液100 μ 1/ 孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值；结果判断0D值大于或等于阴性对照(小鼠 免疫前血清1 100倍稀释)的2.1倍为抗体阳性。呈抗体阳性的最大稀释倍数即为抗体 效价。表2B细胞表位肽免疫鼠血清效价 抗破伤风外毒素C片段B表位肽血清的特异性取已处理的破伤风外毒素C片段，并设定蛋白质分子量标准，在5%浓缩胶，12% 分离胶上进行垂直SDS-PAGE，80V，30分钟，调整电压为150V，约1. 5小时。电泳结束后，取 下凝胶，一块用考马斯亮蓝R-250染液快速染色，另一块置于硝酸纤维素膜上，15V恒压电 转移过夜。转移后的硝酸纤维素膜在丽春红S中染色1分钟，标记蛋白质分子标准，再用蒸 馏水脱去红色。将转移膜置于封闭液(TTBS)中，37°C，150rpm，轻轻振摇封闭60分钟弃去 封闭液，用洗涤液(TTBS)漂洗膜4次，每次10 15分钟。加入以洗涤液1 1000稀释 的鼠抗破伤风外毒素C片段B表位肽抗血清，370C，150rpm,轻轻振摇反应60分钟。TBS漂 洗膜4次，每次10 15分钟。加入以TBS稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(l 10000), 150rpm,轻轻振摇反应60分钟。TBS漂洗4次，每次10 15分钟。加入DAB显色液，轻摇 至显色，蒸馏水漂洗终止反应。结果间接ELISA结果显示4条合成多肽均能分别刺激Balb/c小鼠产生抗特异多 肽和破伤风外毒素C片段的抗体，鼠血清抗体与多肽和破伤风外毒素C片段反应的效价如 表2所示，而免疫前的鼠血清与PBS免疫对照组血清检测为阴性，此结果表明本发明的4条 多肽具有较好的免疫原性和反应原性，为B细胞表位肽。免疫印迹结果如图1所示4条B 细胞表位肽刺激Balb/c小鼠产生的抗体均有很好的特异性，均能与破伤风外毒素C片段特 异反应。实施例2免疫小鼠攻毒试验初步筛选保护性B细胞表位肽上述免疫小鼠末次免疫10天后每只小鼠腹腔注射致死剂量(LDltltl, 1 μ g/kg)的天 然破伤风外毒素，观察5天内各组小鼠的存活率。对照组PBS替代多肽进行免疫和攻毒，方 法及程序相同。天然破伤风外毒素攻毒保护试验结果显示小鼠腹腔注入1 μ g/kg(LD100)剂量天 然破伤风外毒素后，各组小鼠均先后出现了较重的中毒症状，表现为皮毛蓬松皱摺、摄食减 少、全身痉挛。尤其以对照组、P1、P2、P3的小鼠中毒症状出现快(24h 72h)，且呈进行性 加重直至死亡，而P4组的小鼠中毒症状出现相对较慢(96h)，症状出现后有部分小鼠能够 逐渐恢复。各组小鼠具体的存活与死亡情况表3所示表3小鼠免疫后攻毒的保护效果观察 P < 0. Olvs PBS ；P > 0. 05vs PBS由表3可见，PBS对照组小鼠攻毒后48h内全部死亡，而P1、P2、P3、P4抗原免疫组 的小鼠能够不同程度的耐受LDltltl的天然破伤风外毒素攻击而得以存活，5天后的存活率分 别为、20%、10%、10%、70%，经χ 2检验分析P4组与PBS对照组有显著性差异(P < 0. 01)， PU P2、P3免疫组和PBS对照组无显著性差异(P > 0. 05)，说明单一的P4B细胞表位肽能 够刺激机体产生中和破伤风毒素的抗体，具有较强的免疫保护作用，而单一的P2、P3、P4B 细胞表位肽保护效率差，但不能排除P2、P3、P4B细胞表位肽联合应用时会产生免疫保护作 用。此结果为利用B细胞表位肽制备破伤风外毒素中和性单克隆抗体和破伤风外毒素肽疫 苗的候选组分提供了有力的实验依据。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的应用<130>10P99065-CN<160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>16<212>PRT<213>破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列<400>1lie Asn Asn Asp lie lie Ser Asp lie Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val151015<210>2<211>12<212>PRT<213>破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列<400>2Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln lie Thr Phe Arg1510<210>3<211>10<212>PRT
<213>破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列<400>3Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr1510<210>4<211>15<212>PRT<213>破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列<400>4lie lie Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu lie Asp Ser Phe Val151015<210>5<211>48<212>DNA<213>编码破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的核苷酸序列<400>5attaataatg atattatatc agatatatct gggtttaatt catctgta48<210>6<211>36<212>DNA<213>编码破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的核苷酸序列<400>6gattccgcgg gagaagttag acaaataact tttagg36<210>7<211>30<212>DNA<213>编码破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的核苷酸序列<400>7ggaaaccctt tacgatatga tacagaatal30<210>8<211>45<212>DNA<213>编码破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的核苷酸序列<400>8attataaaaa gatatacacc taataatgaa atagattctt ttgtt4权利要求
一种来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽在制备预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的制剂中的应用，其中所述破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1-4所示。
2.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述制剂为抗破伤风毒素单克隆抗体。
3.一种预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的药物，其特征在于包含至少一个来自破伤 风外毒素C片段的B细胞表位肽，和药学上可接受的载体，其中所述破伤风外毒素C片段的 B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。
4.根据权利要求3所述的预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的药物，其特征在于，所述 药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表 面活性剂、吸附载体中的至少一种。
5.一种预防、诊断或治疗破伤风梭菌感染的疫苗，其特征在于包含至少一个来自破伤 风外毒素C片段的B细胞表位肽，其中所述破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO 1-4所示。
全文摘要
本发明涉及来自破伤风外毒素(Tetanus toxion，TT)C片段的B细胞表位肽的应用，来自破伤风外毒素C片段的B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO1-4所示，其可用于制备预防或治疗破伤风梭菌感染的药物，或制备抗破伤风毒素单克隆抗体。本发明还提供预防或治疗破伤风梭菌感染的药物和预防或治疗破伤风梭菌感染的疫苗。
文档编号A61K38/08GK101837117SQ201010197830
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者余抒, 刘唯, 张卫军, 罗萍, 赵 卓, 邹全明, 陈立, 顾江 申请人:中国人民解放军第三军医大学