一株牛支原体nadh氧化酶的单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一株牛支原体NADH氧化酶的单 克隆抗体及应用。该单克隆抗体是由交瘤细胞株8B7分泌的，所述的NADH氧化酶是一种牛 支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADH oxidase，简称Ν0Χ)。
【背景技术】
[0002] 牛支原体（Mycoplasma bovis,简称M. bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物， 是导致我国牛呼吸综合征的主要病原体，主要临床症状为肺炎，还可导致乳腺炎、关节炎、 生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状。剖检病理变化主要集中在胸腔与肺部，表现为肺 和胸膜发生不同程度的粘连并有少量积液。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶 牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。此后，牛支原体肺炎和乳 腺炎已给欧、美各国造成了巨大的经济损失（Caswell等，2010 ;White等，2010)。据估计， 欧洲每年约有25%~33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1. 44~1. 92 亿欧元，其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15. 7万头。美国每年由于 牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1. 40亿美元，牛场感染率可达 70%〇
[0003] 随着我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度 提高，肉牛"异地育肥"已成为重要的肉牛养殖模式。长距离运输是"异地运输"的重要环 节，运输应激可诱发多种重要疫病，牛支原体肺炎就是其中一种。2008年，湖北省从外地引 进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体 质弱的牛发病严重。发病率为50%~100%。临床治疗周期长，效果差，病死率平均10%， 可高达60%，给我国养牛业带来了巨大损失。本实验室于2008年率先确定该病为"传染性 牛支原体肺炎"（石磊等，2008)。随后，不同研宄群体均证实该病在全国广泛流行（胡长敏 等，2009 ;辛九庆等，2008)。此外，近年来奶牛乳腺炎致新生犊牛爆发牛支原体肺炎的事件 也频繁发生。在病原学和流行病学研宄基础上，本室完成了牛支原体HB0801的基因组序列 解析（GenBank 登录号：CP002058) (Qi 等，2012)。
[0004] 牛支原体无细胞壁，对常用β内酰胺类抗生素不敏感，对其它药物如四环素、大 环内脂类和氟喹酪酮类等敏感药物的耐药性也在迅速增加（Mustafa等，2013)。迄今为止， 尚无有效疫苗预防该病。因此，早期诊断和治疗是控制该病的唯一方法。
[0005] 目前该病的诊断方法主要有病原体分离鉴定、血清抗体检测和核酸诊断三类。牛 支原体的分离和鉴定，至少需要3天时间，分离需特殊营养，菌落观察需在低倍显微镜下， 支原体种的鉴定还需辅助PCR和/或测序方法；血清抗体检测只能说明牛体感染过牛支原 体，在流行病学调查中有意义，但不能作为牛支原病的诊断依据。针对牛支原体的PCR和等 温环介导方法灵敏度高，但前者需要特殊仪器设备和较高的实验操作技能，且都容易因污 染核酸而出现假阳性。因此，临床上急需一种能检测牛支原体抗原的检测方法，获得特异性 高亲合力的单克隆抗体是建立牛支原体抗原检测方法的前提和基础。当然，单克隆抗体还 可在致病机理研宄、治疗药物开发等方面具有广泛的用途。
[0006] 虽然国外和国内先前都有报道研制成功牛支原体单克隆抗体，但单克隆抗体针 对的抗原均为未知，限制了这些单克隆抗体的应用（Rasberry等，1992)。本申请人所在 的农业微生物学国家重点实验室的课题组对牛支原体HB0801株进行了基因组测序分析 (GenBank登录号：CP002058)，结果表明，牛支原体是一种变异性极高的原核生物，针对牛 支原体本地流行株表面相对保守、且免疫原性良好的蛋白抗原制备的单克隆抗体，将具有 更为广阔的应用前景。本发明从该指导思想出发，克隆表达了牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸氧化酶（NADH oxidase，简称Ν0Χ);以重组rNOX免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，筛选获得 一株高亲合力的单克隆抗体，经过免疫印迹和免疫荧光实验验证该抗体特异性良好，灵敏 度高，并具有牛支原体检测能力。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种牛支原体表面保守蛋白rNOX的新型单克隆抗体，该 单克隆抗体是一种牛支原体烟酰胺腺嗓呤二核苷酸氧化酶（NADH oxidase, Ν0Χ)，由杂交瘤 细胞株8B7分泌，该单克隆抗体可以特异、灵敏和稳定地识别牛支原体。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种在体外条件下对牛支原体NOX单克隆抗体的 抗原检测方法，用于牛支原体的标记和临床检测。
[0009] 本发明的技术方案如下所述：
[0010]申请人的前期工作是2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺 组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名牛支原体HB0801， Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养 物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO :M2010040。 toon] 本发明根据大肠杆菌的密码子偏爱性，将申请人的前期分离得到一株牛支原体本 地分离株即牛支原体HB0801的NOX基因进行克隆、修饰，进而在大肠杆菌中表达。提取纯 化重组（或简写为rNOX)蛋白；用重组NOX蛋白免疫小鼠，抗体上升后，用获得的免疫鼠脾 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得一株杂交瘤细胞；进一步用NOX筛选，获得能稳定分 泌高亲合力的牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞。申请人将该细胞株命名为杂交瘤细胞株 8B7,于2014年12月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保 藏号为CCTCC N0:C2014221。该杂交瘤细胞株8B7可以在含有15%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37°C，5% 0)2的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆 透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗牛支原体的单克隆抗体。
[0012] 本发明的应用是将杂交瘤细胞8B7在小鼠腹腔接种，制备小鼠腹水，从腹水中提 纯单克隆抗体；进一步建立检测牛支原体抗原的免疫荧光检测法等生物学功能验证。
[0013] 本发明制备的杂交瘤细胞株8B7和单克隆抗体8b7可以作为制备检测牛支原体的 抗原制剂或试剂盒中的应用。
[0014] 一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体感染细胞中的应用，其应用过程如下：
[0015] 将牛支气管上皮细胞（中国农业科学院哈尔滨兽医研宄所赠送）于6孔板中培养 12小时，每孔细胞量为IO 6个。无菌磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三次后，实验组每孔加入ImL MEM液体培养基和IO9CFU牛支原体，对照组加入ImL MEM液体培养基。37°C感染2小时后， 大量PBS洗去未结合的牛支原体。用4%的多聚甲醛室温固定10分钟，然后使用0.5%的 TritonX-IOO通透5分钟，PBS洗涤3次后，用含5% (m/v)牛血清白蛋白（BSA，购自Sigma 公司）的PBS溶液37°C封闭1小时。PBS洗涤三次后加入ImL含5% (m/v)BSA(购自Sigma 公司）的PBS溶液和1 μ L 8b7单克隆抗体37°C孵育1小时。用PBS洗涤三次，加入3000 倍稀释的FITC标记的羊抗鼠的二抗，37°C孵育1小时后，PBS洗涤三次，用IOOnM的罗丹明 室温染色30分钟。PBS洗涤三次，使用DAPI对细胞核染色，室温染色5min。PBS洗涤三次 后，使用抗荧光猝灭剂封片。在激光共聚焦显微镜下观察实验结果（图4)。
[0016] 与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0017] 本发明是针对牛支原体表面特定且保守的膜蛋白Ν0Χ，该蛋白具有免疫原性，制备 了针对重组NOX单克隆抗体；利用Western blot检测证实，本发明制备的单抗能特异性地 识牛支原体和与其近缘的无乳支原体，但不识别其他支原体。利用本发明制备的单抗可应 用在一种免疫荧光法上，该方法可检测感染细胞中的牛支原体。
[0018] 更详细的发明方案见"【具体实施方式】"所述。
【附图说明】
[0019] 序列表SEQ ID NO: 1是修饰后的牛支原体NOX基因的核苷酸序列（原基因来源： Mycoplasma bovis HB0801 菌株，原基因的登录号 GenBank Accession:CP002058) ;Ν0Χ 基 因在基因组中的位置：350685……349321 (reverse)。该修饰后的牛支原体NOX基因的核苷 酸序列如1-1365位碱基所示，该基因结尾的终止密码子为TAA，该终止密码子不包括在制 作本序列中）。
[0020] 序列表SEQ ID NO: 2是牛支原体重组的NOX基因编码的蛋白质序列，共编码454 个氨基酸序列。
[0021] 图1 :重组rNOX蛋白酶活性检测。附图标记说明：图中rNOX为实验组；无 NADH为 对照组；无 rNOX为空白组。
[0022] 图2 :本发明制备的单克隆抗体8b7纯化后的SDS-PAGE照片。附图标记说明：
[0023] 泳道：M :参考蛋白；1 :纯化前的腹水；2纯化后的单克隆抗体8b7。
[0024] 图3 :利用Western blot方法鉴定单克隆抗体8b7的抗原表位和特异性