本发明涉及一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
非天然α-氨基酸是区别于能够由生物体自身合成的22种天然α-氨基酸的一大类氨基酸，它们具有重要的生物活性和生理作用，广泛用于多肽、手性药物以及生物碱等化合物的合成。α-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。α-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成，市场巨大。
α-氨基丁酸的合成方法主要包括化学合成法、酶拆分法及酶转化法三种。其中化学法包括脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原法等，化学合成虽然操作简单，但往往反应条件苛刻且易生成副产物，有时需要利用对环境有害的大量有机溶剂，如Jeffery E.A.等利用电化学法制备得α-氨基丁酸，产率仅有48％，同时存在副产物谷氨酸。相比之下，微生物法制备α-氨基丁酸具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。并且随着基因工程技术的发展，构建重组微生物合成非天然氨基酸代谢途径已经可以完成。目前，α-氨基丁酸的微生物法制备主要通过细胞外酶转化法，包括对消旋α-氨基丁酸进行酶法拆分制备及以2-丁酮酸为原料通过脱氢酶或转氨酶来催化制备。
在之前的研究中，发明人构建了以大宗化学品L-苏氨酸为廉价底物，通过L-苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶及辅酶再生系统的酶体系进行一步法制备α-氨基丁酸。以酶转化过程中发现L-苏氨酸脱氨酶的量需要精确控制，不然会造成中间产物酮丁酸的积累，从而抑制了酮丁酸到α-氨基丁酸的转化，造成了酶转化生产α-氨基丁酸的中断。同时，利用酶转化体系去进行α-氨基丁酸的生产需要对产酶的三种重组菌进行细胞破碎，工艺繁琐成本高昂，同时在转化的过程中因酶的失活而影响了转化的稳定性，另外因辅因子的损耗需要不断地外源添加，进一步增加了α-氨基丁酸的生产成本。因此，有必要寻找一种高效稳定但成本低廉的制备α-氨基丁酸的方法。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了利用rbs序列优化控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量，同时将其与L-氨基酸脱氢酶及提供辅因子NADH循环的脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中的表达，构建成重组大肠杆菌单细胞工厂，利用该单细胞工厂进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸的方法。
本发明构建了能高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂，主要通过利用rbs优化控制L-苏氨酸脱氨酶(ltd)在重组菌中的表达量，以达到控制中间产物酮酸的积累量，同时利用启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的生成速率，最后将不同rbs强度的L-苏氨酸脱氨酶与L-氨基酸脱氢酶基因及经过启动子以及rbs序列优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶构建在大肠杆菌表达系统中的重组共表达载体，并将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中，成功构建了不同的基因工程菌单细胞工厂。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用这些单细胞工厂进行全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸进行转化高效制备α-氨基丁酸，为α-氨基丁酸的工业化生产提供了一种实际有效策略。
本发明的第一个目的是提供一种高效合成α-氨基丁酸的重组菌单细胞工厂，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因；其中，以L-氨基酸脱氢酶基因的表达为基准，控制供辅因子NADH循环的脱氢酶的表达量使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平，控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量处于相对较合适的水平。
所述的重组菌单细胞工厂能得到较优的从L-苏氨酸到中间产物酮丁酸及从酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不会造成中间产物酮丁酸的积累因而不会造成对反应的抑制。同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子，相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。
在一种实施方式中，所述控制，是通过但不限于，启动子以及rbs序列优化，也可以是增强子、终止子、沉默子优化等。
在一种实施方式中，所述控制是通过启动子和/或rbs序列优化来进行。
所述重组菌单细胞工厂的构建方法，包括：
(1)根据启动子及L-苏氨酸脱氨酶的基因序列，设计不同强度的rbs序列用来控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量从而控制L-苏氨酸到酮丁酸的转化速率；
(2)对辅因子NADH的供应速率进行了调控，主要是对启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的再生速率；
(3)将rbs优化后的L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、启动子以及rbs优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因按顺序连接，构建重组共表达载体，并将重组共表达载体转化宿主菌中，构建基因工程菌单细胞工厂。
在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶基因前有质粒载体自身携带的启动子、针对L-苏氨酸脱氨酶基因和质粒载体设计的表达强度低于质粒载体本身rbs的rbs序列；所述L-苏氨酸脱氨酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因之间通过质粒载体自身携带的rbs连接；所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前有针对提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因和质粒载体设计的启动子、表达强度高于或等于质粒载体本身rbs的rbs序列。
在一种实施方式中，所述宿主菌可以是大肠杆菌，也可以是其他宿主，比如枯草芽孢杆菌、棒杆菌、酵母等。
在一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。
在一种实施方式中，所述质粒载体可以是任意一种可商业化购买的质粒载体，或者是任意一种已有报道的经改造的质粒载体。
在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶选自但不限于大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶(核苷酸序列是NCBI上Gene ID:948287)。
在一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氢酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID:1206507)、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID:936557)、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID:1099526)、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID:4219741)。
在一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶选自：但不限于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(NCBI上GenBank:KM454879.1)、枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(NCBI上GeneID:938261)、恶臭假单胞杆菌的葡萄糖脱氢酶(NCBI上Gene ID:1045820)。
在一种实施方式中，所述rbs序列，可以是不同强度的rbs序列。
在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶基因前的启动子或rbs序列，可以是针对不同表达系统进行优化得到的。
在一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前的启动子或rbs序列，也可以是针对不同表达系统进行优化得到的。
在一种实施方式中，所述表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统，也可以是枯草芽孢杆菌表达系统、棒杆菌表达系统、酵母表达体系等。
在一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌；所述L-苏氨酸脱氨酶基因前的启动子为T7启动子；L-苏氨酸脱氨酶基因前直接连接的rbs序列为序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列中的任意一种；所述L-苏氨酸脱氨酶基因和L-氨基酸脱氢酶基因通过序列为SEQ ID NO:22所示序列的RBS连接。
在一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前的启动子为tac启动子，rbs序列为SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39中的任意一种。可选地，rbs序列为SEQ ID NO:37的序列。
在一种实施方式中，所述重组共表达载体是在质粒载体pET-28a的基础上构建得到的；L-苏氨酸脱氨酶基因和L-氨基酸脱氢酶基因通过pET-28a自身携带的rbs直接连接。
本发明的第二个目的是提供一种发酵合成α-氨基丁酸的方法，是利用本发明的重组菌单细胞工厂。
在一种实施方式中，所述方法，是将重组菌单细胞工厂活化后转接于发酵培养基中，IPTG诱导表达或直接表达重组蛋白，离心收集菌体，然后利用菌体全细胞转化生产α-氨基丁酸。
在一种实施方式中，发酵培养基中具备微生物生长所需的营养成分，即碳源、氮源、无机盐、生长因子等；碳源包括葡萄糖、甘油等；氮源主要有酵母膏、蛋白胨等，以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等；另外，培养基中还可以适量加入金属离子。
在一种实施方式中，所述发酵培养基为TB培养基、TY培养基、TYG培养基或者GP培养基。
在一种实施方式中，所述全细胞转化是将获得的菌体洗涤后，再加入pH 7.5的50mM PB缓冲液重悬，然后于30℃下加入底物L-苏氨酸及甲酸或甲酸盐或葡萄糖，以20％甲酸或1M盐酸及5M氨水控制pH在7.5左右。
本发明还要求保护所述的重组菌单细胞工厂应用于α-氨基丁酸、酮丁酸或其相关附属产物的合成。
本发明的有益效果：
α-氨基丁酸一种重要的化工原料和医药中间体，被广泛用于药物的合成如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成。本发明首次构建了重组L-苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶及提供辅因子NADH循环的脱氢酶的单细胞工厂，利用rbs序列优化控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量，可以有效控制作为转化过程中中间产物酮丁酸的积累量，因为一定量的酮丁酸会抑制转化过程的进行，同时利用启动子及rbs序列优化控制了提供辅因子NADH的脱氢酶表达量，优化了辅因子NADH的再生速率，最后将其与高效的氨基酸脱氢酶串联到质粒上并分别在大肠杆菌表达体系中的表达，构建了重组菌单细胞工厂，利用该单细胞工厂进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸。利用该单细胞工厂对L-苏氨酸进行全细胞转化为α-氨基丁酸，转化过程操作简单、重组菌培养成本低廉，且转化过程中不需要添加任何辅因子，转化批次稳定无中断现象，在提高转化效率的同时降低了成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。
实施例1：L-苏氨酸脱氨酶的rbs序列优化及重组L-苏氨酸脱氨酶大肠杆菌的构建
[1]将来源于大肠杆菌L-苏氨酸脱氨酶基因ltd序列结合T7启动子针对其在大肠杆菌中的表达量设计了不同表达强度的rbs序列，然后送至上海生工生物进行基因合成。PCR引物包括含有不同表达强度的rbs序列(用下划线加粗表示，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示)的引物rbs1、rbs2、rbs3、rbs4、rbs5、rbs6及L-苏氨酸脱氨酶基因的末端引物ltdR(序列如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:13)。
ltdR：5’-CGGGATCCTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(BamH I)
[2]以含有不同表达强度的rbs序列的引物、末端引物ltdR组成引物对，利用大肠杆菌的染色体DNA作为模板，进行PCR扩增，即可得到能够表达出不同表达量的L-苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列。比如，以rbs1、ltdR为引物进行扩增，即可得到一段核苷酸片段，这段核苷酸片段含有L-苏氨酸脱氨酶基因且L-苏氨酸脱氨酶基因前直接连接有一段rbs序列。
[3]将上一步得到的能够表达出不同表达量的L-苏氨酸脱氨酶的核苷酸片段分别连接到质粒载体pET-28a上(分别用Xba I和BamHI进行双酶切，然后连接)，得到6个重组质粒pET-28a-rbs1-ltd、pET-28a-rbs2-ltd、pET-28a-rbs3-ltd、pET-28a-rbs4-ltd、pET-28a-rbs5-ltd、pET-28a-rbs6-ltd，将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到重组L-苏氨酸脱氨酶大肠杆菌。
[4]将[3]中所构建好的重组L-苏氨酸脱氨酶大肠杆菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100ml的LB基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1mM的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。对L-苏氨酸脱氨酶的酶活力进行测试，取培养好的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mL pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，将重组大肠杆菌重悬于10mL的50mM PB缓冲液中。将悬浮好的细胞放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，破1s，停3s，300W的功率工作时间10min。取破碎液于离心机内4℃，10000r/min离心30min去除沉淀，测定上清液酶活。
[5]L-苏氨酸脱氨酶酶活测定方法：利用0.1M的pH 7.5的PB缓冲液来配制40mM的苏氨酸底物溶液。将0.96mL的底物缓冲液加入到比色皿中，再加入40μL的酶液并立即混匀。通过计算酶反应液在230nm紫外光下吸光值的变化去测定酮丁酸浓度的变化，然后与酮丁酸的标准曲线对照得出酮丁酸的浓度变化值。酶活的定义为：每分钟产生的1μmol的α-酮丁酸所需的酶量。
[6]结果显示重组L-苏氨酸脱氨酶大肠杆菌pET-28a-rbs1-ltd/BL21、pET-28a-rbs2-ltd/BL21、pET-28a-rbs3-ltd/BL21、pET-28a-rbs4-ltd/BL21、pET-28a-rbs5-ltd/BL21及pET-28a-rbs6-ltd/BL21在LB培养基中所诱导出的酶活分别为0.13U/mL、0.34U/mL、0.72U/mL、2.56U/mL、4.89U/mL、11.6U/mL。
实施例2：共表达L-苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶的重组质粒和重组菌的构建
[1]以蜡样芽孢杆菌、红球菌、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据L-氨基酸脱氢酶基因序列和pET-28a质粒上的酶切位点设计L-氨基酸脱氢酶基因引物，包括蜡样芽孢杆菌的L-亮氨酸脱氢酶基因Bcldh(引物为PBcldhF、PBcldhR)、红球菌的L-苯丙氨酸脱氢酶基因Rjpdh(引物为PRjpdhF、PRjpdhR)、枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因Bsadh(引物为PBsadhF、PBsadhR)、天蓝色链霉菌的缬氨酸脱氢酶基因Scvdh(引物为PScvdhF、PScvdhR)。引物序列如下(如SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:21)：
PBcldhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATAT C-3’(Sac I)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)
PBsadhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGATCATAGGGGTTCCT-3’(BamH I)
PBsadhR：5’-CGAGCTCTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Sac I)
PScvdhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(BamH I)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Sac I)
其中下划线为pET-28a质粒载体上本身携带的rbs序列；引物命名方式：P+菌株种属首字母+基因名称+引物方向，即PBcldhF代表用于扩增来源于蜡样芽孢杆菌的ldh基因的上游引物。
[3]分别以蜡样芽孢杆菌、红球菌、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板，利用上述对应的引物进行PCR扩增，得到含有L-氨基酸脱氢酶基因的核苷酸片段且该基因前直接连接有pET-28a质粒载体上本身携带的rbs序列AAGGAG(序列如SEQ ID NO:22所示)。
[4]将上一步得到的多个含有L-氨基酸脱氢酶基因的核苷酸片段与实施例1构建的重组质粒pET-28a-rbs1-ltd、pET-28a-rbs2-ltd、pET-28a-rbs3-ltd、pET-28a-rbs4-ltd、pET-28a-rbs5-ltd、pET-28a-rbs6-ltd连接(核苷酸片段与质粒分别用BamHI和Sac I进行双酶切，然后连接)，得到能够共表达L-苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶的重组质粒pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh等，然后将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到共表达L-苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶的重组菌。
实施例3：提供辅因子NADH循环的脱氢酶重组大肠杆菌的构建及甲酸脱氢酶的启动子及rbs序列优化的重组大肠杆菌的构建
[1]根据不同来源的提供辅因子NADH循环的脱氢酶的基因序列及串联到pET-28a质粒上的酶切位点设计引物，其中包括博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶fdh(引物为PfdhF、PfdhR)、枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶Bsglcdh(引物为PBsglcdhF、PBsglcdhR)、恶臭假单胞杆菌的葡萄糖脱氢酶Ppglc(引物为PPpglcdhF、PPpglcdhR)。分别以相应的引物、基因组模板进行PCR，得到相应菌株来源的提供辅因子NADH循环的脱氢酶的基因片段，将其与pET-28a质粒连接(核苷酸片段与质粒分别用BamHI和Sac I进行双酶切，然后连接)，得到表达提供辅因子NADH循环的脱氢酶的重组质粒pET-28a-fdh、pET-28a-Bsglcdh、pET-28a-Ppglcdh，将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到表达提供辅因子NADH循环的脱氢酶的重组菌。
比如，以PBsglcdhF、PBsglcdhR为引物对、枯草芽孢杆菌染色体DNA作为模板进行扩增，得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段，将其与pET-28a质粒连接(核苷酸片段与质粒分别用BamH I和Sac I进行双酶切，然后连接)，得到表达来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的重组质粒pET-28a-rbs2-Bsglcdh，将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到表达提供辅因子NADH循环的来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的重组菌。
其中引物序列(如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:32)如下：
PBsglcdhF：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’(BamH I)
PBsglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Hind III)
P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)
PBsglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Bgl II)
PPpglcdhF：5’-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’(BamH I)
PPpglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Hind III)
PPpglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Bgl II)
PfdhF：5’-ACCGGGATCCATGAAAATCGTTCTGGTTCTG-3’(BamH I)
PfdhR：5’-CGCGTCGACTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(Sal I)
PfdhRBglII：5’-GAAGATCTTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(Bgl II)
[2]以甲酸脱氢酶为例，还可以进行以下优化：
同时选取了tac启动子，并根据pXMJ-19质粒上的tac启动子及甲酸脱氢酶的基因序列，设计含有不同强度的rbs序列(用下划线加粗表示，如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示)的PCR引物r1FDH、r2FDH、r3FDH、r4FDH、r5FDH、r6FDH、r7FDH，及甲酸脱氢酶基因的末端引物pFDHRBamHI。
其中引物序列(如SEQ ID NO:40～SEQ ID NO:49)如下：
pFDHRBamHI:5’-CGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(BamHI)
pTacFSphI:5’-CATGCATGCTGACAATTAATCATCGGCT-3’(Sph I)
prrnBRBglII:5’-GAAGATCTAGAGTTTGTAGAAACGC-3’(Bgl II)
利用博伊丁假丝酵母的染色体DNA作为模板，分别以含有不同强度的rbs序列的引物和pFDHRBamHI组成引物对，进行PCR，得到多条含有rbs序列和甲酸脱氢酶的基因片段，将其与pXMJ-19质粒连接(核苷酸片段与质粒分别用Hind III和BamH I进行双酶切，然后连接)，得到表达甲酸脱氢酶的重组质粒pXMJ-19-r1fdh、pXMJ-19-r2fdh、pXMJ-19-r3fdh、pXMJ-19-r4fdh、pXMJ-19-r5fdh、pXMJ-19-r6fdh、pXMJ-19-r7fdh，将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到表达提供辅因子NADH循环的甲酸脱氢酶的重组菌。
比如，以r1FDH、pFDHRBamHI为引物对、博伊丁假丝酵母基因组作为模板进行扩增，得到来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因片段，将其与pXMJ-19质粒连接(核苷酸片段与质粒分别用Hind III和BamH I进行双酶切，然后连接)，得到表达甲酸脱氢酶的重组质粒pXMJ-19-r1fdh，将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到表达提供辅因子NADH循环的甲酸脱氢酶的重组菌。
[3]将[1]和[2]中所构建好的表达有甲酸脱氢酶的重组菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100ml的LB基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。对甲酸脱氢酶的酶活力进行测试实验，取培养好的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mL pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，将重组大肠杆菌重悬于10mL的50mM PB缓冲液中。将悬浮好的细胞放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，破1s，停3s，300W的功率工作时间10min。取破碎液于离心机内4℃，10000r/min离心30min去除沉淀，测定上清液酶活。
[4]甲酸脱氢酶酶活测定方法：利用0.1M的pH 7.5的PB缓冲液来配制100mM的甲酸钠底物溶液。将0.96mL的底物缓冲液加入到比色皿中，再加入40μL的酶液并立即混匀。通过计算酶反应液在340nm紫外光下吸光值的变化去测定生成NADH浓度的变化，然后与NADH的标准曲线对照得出NADH的浓度变化值，也可以根据NADH的摩尔消光系数利用公式计算得出酶活。酶活的定义为：每分钟产生的1μmol的NADH所需的酶量。
[5]结果显示重组菌pET-28a-fdh/BL21、pXMJ-19-r1fdh/BL21、pXMJ-19-r2fdh/BL21、pXMJ-19-r3fdh/BL21、pXMJ-19-r4fdh/BL21、pXMJ-19-r5fdh/BL21、pXMJ-19-r6fdh/BL21以及pXMJ-19-r7fdh/BL21在LB培养基中所诱导出的酶活分别为0.34U/mL、0.12U/mL、0.15U/mL、0.14U/mL、0.27U/mL、0.56U/mL、0.37U/mL、0.41U/mL。因此，以pXMJ-19-r5fdh质粒为基因来源进行下一步串联表达。
实施例4：高效合成α-氨基丁酸的重组大肠杆菌单细胞工厂的构建
[1]以pET-28a-Bsglcdh为模板、P28aPromoterF和PBsglcdhRBglII为引物，进行PCR扩增，得到携带pET-28a质粒载体本身的T7启动子、pET-28a自带rbs以及枯草来源的葡萄糖脱氢酶的核苷酸片段；以pET-28a-Ppglcdh为模板、P28aPromoterF和PPpglcdhRBglII为引物，进行PCR扩增，得到携带pET-28a质粒载体本身的T7启动子、pET-28a自带rbs以及恶臭假单胞杆菌来源的葡萄糖脱氢酶的核苷酸片段；以pXMJ-19-r5fdh质粒作为模板、pTacFSphI和prrnBRBglII为引物进行扩增，得到携带pXMJ-19质粒载体本身的tac启动子、pXMJ-19自带rbs以及博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶的核苷酸片段。
[2]上一步得到的3个核苷酸片段连接到pMD18-T上，构建得到重组质粒pMD18-T-promoter+Bsglcdh、pMD18-T-promoter+Ppglcdh、pMD18-T-tac-promoter+r5fdh，导入感受态E.coli JM109，验证转化子。
[3]从[2]中转化子中提取相应的质粒，与实施例2中已经串联有不同rbs序列的L-苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶的表达载体pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh分别用Sph I和Bgl II进行双酶切，然后连接。将连接好的重组质粒pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh转化到感受态E.coli BL21，酶切验证正确的菌株即为合成α-氨基丁酸重组大肠杆菌单细胞工厂。
实施例5：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD6000.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl280μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例6：大肠杆菌重组菌的发酵培养基
[1]LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
[2]TB培养基(g/L)：甘油4，胰蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO412.5，KH2PO42.3，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[3]TY培养基(g/L)：葡萄糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 3，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[4]TYG培养基(g/L)：甘油10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[5]GP培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
实施例7：表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌单细胞工厂全细胞转化产α-氨基丁酸
[1]将实施例4步骤[3]得到的重组大肠杆菌单细胞工厂
pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21分别利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100mL的LB培养基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。进行全细胞转化实验，取不同培养基中培养好的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mL pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，分别将重组大肠杆菌重悬于100mL的pH7.5的50mM PB缓冲液中。向该体系中投入0.8M L-苏氨酸和0.8M甲酸铵及0.1％(v/v)tween-80，置30℃摇床中继续培养，培养过程中每隔0.5h加入20％甲酸或5M氨水以保持反应液pH为7.5。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UVDetector，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]有机酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：10μL，流速：0.6ml/min。
[4]氨基酸测定结果显示pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21全细胞转化制备α-氨基丁酸的产量分别为22.1g/L、48.5g/L、66.2g/L、81.8g/L、40.6g/L、39.2g/L。其中pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21重组菌全细胞转化液中L-苏氨酸均有残留，且并未检测到中间产物酮丁酸的积累，说明rbs1/rbs2/rbs3所诱导出的L-苏氨酸脱氨酶酶活较低，不能够满足α-氨基丁酸的高效生产。而pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21重组菌全细胞转化液中分别检测出40.7g/L及41.4g/L的中间产物酮丁酸，因前期实验已经显示来源于蜡样的亮氨酸脱氢酶转化速率较快完全满足产物的快速积累，说明可能是L-苏氨酸脱氨酶的表达量较高导致中间产物的积累进而抑制了转化的进行。
[5]将重组菌pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.5的50mM PB缓冲液将重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸及1M甲酸铵，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH6.0。待转化20h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析，得到α-氨基丁酸的产率分别为86.2g/L、99.6g/L及43.1g/L。
实施例8：重组菌pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21在不同发酵培养基培养后进行全细胞转化产α-氨基丁酸
将重组菌pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的TB基、TY基、TYG基及GP基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.5的50mM PB缓冲液将重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1.8M L-苏氨酸和1.8M甲酸铵，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH7.5。待转化10h及20h后分别取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。发现L-苏氨酸到α-氨基丁酸在TB基、TY基、TYG基及GP基发酵后的全细胞转化20h后转化率均可以达到98％以上，但是在10h时的转化率差别较大，分别为68％，46％，49％，64％，因酵母提取物的成本相比于葡萄糖来说较高，因此确定最佳的发酵培养基为GP培养基，其最终α-氨基丁酸的产量达到181g/L，时空产率为9.05g/L·h。
实施例9：表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌单细胞工厂全细胞转化产α-氨基丁酸
[1]将实施例4步骤[3]得到的重组大肠杆菌单细胞工厂
pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21重组菌重组菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.5的50mM PB缓冲液将重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸及1M葡萄糖，于30℃、300r/min进行转化，并以1M盐酸或者5M氨水调节使pH7.5。待转化18h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
[2]氨基酸测定结果显示pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21全细胞转化制备α-氨基丁酸的产量分别为33.5g/L、89.1g/L、100.2g/L、27.8g/L。其中pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21重组菌全细胞转化液中并未检测到中间产物酮丁酸的积累，而重组菌pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21全细胞转化液中检测出73.6g/L的中间产物酮丁酸，说明在以葡萄糖脱氢酶为辅酶NADH再生用酶时利用rbs4及rbs5序列去诱导L-苏氨酸脱氨酶表达时有利于α-氨基丁酸的制备，其中以rbs5序列为L-苏氨酸脱氨酶的核糖体结合位点序列最佳。
实施例10：重组菌pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21在不同发酵培养基培养后进行全细胞转化产α-氨基丁酸
将重组菌pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的TB培养基、TY培养基、TYG培养基及GP培养基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.5的50mM PB缓冲液将重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入2M L-苏氨酸和2M葡萄糖，于30℃、300r/min进行转化，并以1M盐酸或者5M氨水调节使pH7.5。待转化10h及20h后分别取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。发现重组菌利用L-苏氨酸转化成α-氨基丁酸在TB培养基、TY培养基、TYG培养基及培养GP基发酵后的全细胞转化20h后转化率也均可以达到98％以上，但是在10h时的转化率差别较大，分别为47％，62％，66％，53％，因此确定最佳的发酵培养基为TYG培养基，其最终葡萄糖酸的产量达390.8g/L，α-氨基丁酸的产量达到204g/L，α-氨基丁酸的时空产率为10.2g/L·h。
综上，本发明采用如下手段可以取得较好的效果：L-苏氨酸脱氨酶基因前有质粒载体自身携带的启动子、针对L-苏氨酸脱氨酶基因和质粒载体设计的表达强度低于质粒载体本身rbs的rbs序列；L-苏氨酸脱氨酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因之间通过质粒载体自身携带的rbs连接；提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前有针对提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因和质粒载体设计的启动子、表达强度高于或等于质粒载体本身rbs的rbs序列。
本发明的重组菌单细胞工厂能得到较优的从L-苏氨酸到中间产物酮丁酸及从酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不会造成中间产物酮丁酸的积累因而不会造成对反应的抑制。同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子，相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<110> 江南大学
<120> 一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用
<160> 49
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtaacaatt tcagcaccgt ttctataacc taat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaacgcaag aattaactac gacaaactcg ggaa 34
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actttctaaa tacctctacc tactctctat aaccc 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taaaatcaca tccaatttac tacggaaata tccac 35
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttaagcaata aaatatatac ttacggttta caa 33
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaacttcctc caacacctac ggttctataa a 31
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctctagaag taacaatttc agcaccgttt ctataaccta atatggctga ctcgcaaccc 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctctagaga aacgcaagaa ttaactacga caaactcggg aaatggctga ctcgcaaccc 60
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctctagaac tttctaaata cctctaccta ctctctataa cccatggctg actcgcaacc 60
c 61
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctctagata aaatcacatc caatttacta cggaaatatc cacatggctg actcgcaacc 60
c 61
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctctagatt aagcaataaa atatatactt acggtttaca aatggctgac tcgcaaccc 59
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctctagaaa acttcctcca acacctacgg ttctataaaa tggctgactc gcaaccc 57
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgggatcctt aacccgccaa aaagaacctg 30
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgggatccaa ggagatatac atgacattag aaatcttcg 39
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgagctctta gcgacggcta ataatatc 28
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgggatccaa ggagatatac atgactctca ccgcggaac 39
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgagctccta cctggctgca gcgatg 26
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgggatccaa ggagatatac atgatcatag gggttcct 38
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgagctctta agcacccgcc acagatg 27
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgggatccaa ggagatatac atggtgaccg acgtaaacgg 40
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgagctctca cggccgggga cgggcct 27
<210> 22
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaggag 6
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cgggatccat gtatccggat ttaaaagg 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cccaagcttt taaccgcggc ctgcctgg 28
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acatgcatgc cgatcccgcg aaattaatac 30
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gaagatcttt aaccgcggcc tgcctgg 27
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cgggatccat gagcactgaa ggtgcgaacc 30
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cccaagcttt tactcggcta atttgtaag 29
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gaagatcttt actcggctaa tttgtaag 28
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
accgggatcc atgaaaatcg ttctggttct g 31
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cgcgtcgact tattttttgt cgtgtttacc 30
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gaagatcttt attttttgtc gtgtttacc 29
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gtacgcaaga atacttaact acggttagag gg 32
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtcatagaaa aatttaacct acggttacag gg 32
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctcatagata gaaataacct acggttacag gg 32
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acaaatactc tataaaaaaa actacggtta gaata 35
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctcatctaat acaatacaaa ctacggttag aaca 34
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
aatctacaat aaatctcaca actacggtta taata 35
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgttaaacaa ggtccaacta cggttaacac a 31
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cccaagcttg tacgcaagaa tacttaacta cggttagagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cccaagcttg tcatagaaaa atttaaccta cggttacagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cccaagcttc tcatagatag aaataaccta cggttacagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 43
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cccaagctta caaatactct ataaaaaaaa ctacggttag aataatgaag atcgttttag 60
tc 62
<210> 44
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cccaagcttc tcatctaata caatacaaac tacggttaga acaatgaaga tcgttttagt 60
c 61
<210> 45
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cccaagctta atctacaata aatctcacaa ctacggttat aataatgaag atcgttttag 60
tc 62
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cccaagcttt gttaaacaag gtccaactac ggttaacaca atgaagatcg ttttagtc 58
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cgggatcctt atttcttatc gtgtttac 28
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
catgcatgct gacaattaat catcggct 28
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gaagatctag agtttgtaga aacgc 25