一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用与流程

本发明属于烟草种植领域，尤其涉及一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用。

背景技术：

烟草属草茄木，茄科一年生或有限多年生草本植物，基部稍木质化。花序顶生，圆锥状，多花；蒴果卵状或矩圆状，长约等于宿存萼。夏秋季开花结果。主要分布于南美洲、南亚、中国。为有效提高烟草产量，提高产能，烟草的病害防治显得尤为重要。

烟草赤星病由烟草赤星病菌引起，是世界各烟草产区烟草生产上威胁最大的病害之一，在我国各烟区均有发生，每年发病面积约占我国种植面积的30～35％。目前，主要采用化学防治为主的防治技术，但药物残留风险及病原菌抗药性风险影响，限制了农药的大规模利用。分离筛选出对赤星病菌具有良好抑制作用和防治效果的拮抗菌是实施生物防治的一项重要工作。

因此，研发出一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用，用于解决现有技术中，化学防治烟草赤星病药物残留风险和病原菌抗药性风险影响，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用，用于解决现有技术中，化学防治烟草赤星病药物残留风险和可能导致病原菌抗药性风险影响，实现烟草赤星病的绿色防控。本发明提供的技术方案筛选而得的烟草赤星病拮抗菌，可发酵培育得到大量的、抑菌活性高的烟草赤星病拮抗菌，对于烟草赤星病的生物防治起到积极的防治作用。

本发明提供了一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法，所述发酵方法为：所述烟草赤星病拮抗菌接种于发酵培养基中，振荡培养，得烟草赤星病拮抗菌；

所述振荡培养的时间为72h。

优选地，所述烟草赤星病拮抗菌的接种量为0.1％～2％。

优选地，所述烟草赤星病拮抗菌的接种量为0.5％。

优选地，所述振荡培养的温度为25～45℃。

更优选地，所述振荡培养的温度为30℃。

优选地，所述发酵培养基的初始pH为5～9。

更优选地，所述发酵培养基的初始pH为6。

优选地，所述振荡培养的转速为130～170r/min。

更优选地，所述振荡培养的转速为150r/min。

优选地，所述发酵培养基的碳源选自：牛肉膏、甘露醇以及D-果糖中的一种或多种。

更优选地，所述发酵培养基的碳源为牛肉膏。

优选地，所述发酵培养基的氮源选自：蛋白胨、酵母浸膏以及胰蛋白胨中的一种或多种。

更优选地，所述发酵培养基的氮源为蛋白胨。

优选地，所述发酵方法还包括：分离提纯；

所述分离提纯步骤在所述振荡培养后进行。

本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的发酵方法培养制得的烟草赤星病拮抗菌在烟草抗病领域的应用。

综上所述，本发明提供了一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法，所述发酵方法为：所述烟草赤星病拮抗菌接种于发酵培养基中，振荡培养，得烟草赤星病拮抗菌；所述振荡培养的时间为72h。本发明还提供了一种上述发酵方法培育制得的烟草赤星病拮抗菌在烟草抗病领域的应用。经检测可得，本发明提供的技术方案培育得到的烟草赤星病拮抗菌，抑菌率显著提高，可用于烟草赤星病的防治。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，振荡培养的时间对于抑菌率的影响结果；

图2为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，接种量对于抑菌率的影响结果；

图3为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，振荡培养的温度对于抑菌率的影响结果；

图4为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，发酵培养基的初始pH对于抑菌率的影响结果；

图5为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，振荡培养的转速对于抑菌率的影响结果；

图6为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，发酵培养基的碳源对于抑菌率的影响结果；

图7为本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法中，发酵培养基的氮源对于抑菌率的影响结果。

具体实施方式

本发明提供了一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用，用于解决现有技术中，化学防治烟草赤星病药物残留风险和可能导致病原菌抗药性风险影响，实现烟草赤星病的绿色防控。本发明提供的技术方案筛选而得的烟草赤星病拮抗菌，可发酵培育得到大量的、抑菌活性高的烟草赤星病拮抗菌，对于烟草赤星病的生物防治起到积极的防治作用。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法及其应用，进行具体地描述。

本发明的下述实施例中，抑菌活性用抑菌率表示，计算公式为：

抑菌率(％)＝【(ck菌落直径-处理菌落直径)/ck菌落直径】*100％

实施例1

本实施例为分离烟草赤星病拮抗菌的具体实施例。

1.1备料

烟草赤星病菌：由江西省烟叶科学研究所实验室分离保存。

土壤样品：采自瑞金市壬田镇烟草种植区烟草赤星病菌感染区的健康烟草植物根际土壤。

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g和去离子水1000mL混合制得。

NA培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂18g和去离子水1000mL混合制得。

高氏I号培养基：可溶性淀粉20g、KNO₃1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl0.05g、FeSO₄·7H₂O0.01g、琼脂18g和去离子水1000mL混合制得。

1.2土壤细菌和放线菌的分离和纯化

称取10g研磨好的土样装入灭菌的三角瓶中，加入90mL无菌水，制成1:10的土壤稀释液，在28℃摇床中充分震荡培养30分钟，然后配成10^-1～10^-5稀释液备用。分别取上述5个浓度土壤稀释液100μL，分别加入已做好的NA和高氏I号平板培养基上，用灭菌的玻璃涂棒将稀释液均匀的涂布，放入28℃恒温箱中培养，设三个重复。通过肉眼观察挑取培养特征不同的单菌落，纯化后保存在4℃冰箱中备用。

1.3平板初筛及抑菌率测定

初筛采用平板对峙法，对分离纯化到的放线菌和细菌，以供试病原真菌为靶标，采用平板对峙培养法，用琼脂平板直接测定。具体方法为：在PDA平板中心接种病原菌菌饼，四周接种待测的放线菌菌株。于28～30℃恒温培养4d，观察是否有抑菌圈产生。有抑菌圈的，测量抑菌圈半径，计算抑菌率。

1.4初筛拮抗菌发酵液抑菌活性复筛

选择在初筛中拮抗性好的放线菌或细菌，以液体发酵培养的方法进行繁殖，测定发酵滤液对病原菌的拮抗性，其方法为：

(1)、放线菌或细菌接入液体培养基，恒温水浴摇床培养，28℃，150r/min，培养72h。

(2)、发酵液预处理：放线菌液体培养72h后取出，静置1h后，在无菌条件下过滤，得发酵滤液。

(3)、生长速率法测定拮抗性：将发酵滤液取3mL注入培养皿中，然后将熔化的PDA培养基(约15mL)倒入皿中与发酵滤液混合均匀，冷却后接病原菌的菌饼。分别以加无菌水的和不接菌的液体发酵培养液的PDA平板为对照，28℃恒温培养3d后测量菌落直径，计算抑制率。

1.5拮抗菌的分子鉴定

将上述抑菌率最优的细菌用常规分子鉴定方法，鉴定拮抗菌的种类。经鉴定，该拮抗菌为芽孢杆菌(Bacillus vanillea)。

实施例2

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，振荡培养的时间对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

以1％接种量将拮抗菌培养液接种到发酵基础培养基中，于28℃，150r/min转速下振荡培养24、48、72、96、120和144h后检测不同振荡培养对菌株抑菌活性的影响，确定最适振荡培养时间。

所得实验结果请参阅图1。由图1可得，振荡培养对发酵液产生抑菌效果的影响较大，抑菌活性呈现先上升后下降的趋势。振荡培养24～72h时抑菌率随着培养时间的增加而逐渐增大，在发酵72h时菌株的抑菌效果最好，抑菌率达到最大，为77.72％。因此，振荡培养72h对赤星病菌的抑菌率与其他7种发酵时间相比较，抑菌效果最佳。

实施例3

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，振荡培养的温度对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

在1％接种量、150r/min转速条件下，选用实施例2中已确定的最适振荡培养时间，分别以20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃6个培养温度进行发酵，检测不同温度对拮抗菌抑菌活性的影响，确定菌株最适振荡培养温度。

所得实验结果请参阅图3。由图3可得，在25～45℃范围内，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，在30℃时抑菌活性最高，抑制率为53.08％。因此，最适宜的振荡培养温度为30℃。

实施例4

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，发酵培养基的初始pH对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

在1％接种量和150r/min转速的条件下，将培养基初始pH值分别设置为5、6、7、8、9和10等6个不同梯度，选用已确定的最适发酵时间和温度进行发酵，检测不同pH值对拮抗菌抑菌活性的影响，确定发酵培养基最适初始pH值。

所得实验结果请参阅图4。由图4可得，在培养基初始pH为5～9范围内，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，在培养基初始为7时抑菌活性最高。因此，最适宜的培养基初始为7。

实施例5

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，接种量对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

在150r/min转速的条件下，分别以0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的接种量将拮抗菌培养液接种到基础培养基中，选用已确定的最适发酵时间、温度和初始pH值进行发酵，检测不同接种量对拮抗菌抑菌活性的影响，确定最适接种量。

所得实验结果请参阅图2。由图2可得，在接种量为0.1％～2％的范围内，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，在接种量为0.5％时抑菌活性最高。因此，最适宜的接种量为0.5％。

实施例6

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，振荡培养的转速对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

设置振荡培养的摇床转速分别为100r/min、130r/min、150r/min、170r/min、190r/min和210r/min共计6个不同转速，并在实施例2～5已确定的最适发酵时间、温度、初始pH值和接种量下进行发酵，检测不同转速对拮抗菌抑菌活性的影响，确定最佳转速。

所得实验结果请参阅图5。由图5可得，在振荡培养的摇床转速为130～170r/min的范围内，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，在振荡培养的摇床转速为150r/min时抑菌活性最高。因此，最适宜的振荡培养的摇床转速为150r/min。

实施例7

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，发酵培养基的碳源对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

碳源是微生物生长必需的一类重要营养物质，培养基中的碳水化合物不仅是微生物生命活动能量的主要来源，而且也是微生物各种代谢产物的主要原料。以碳源添加量为0.3％的比例，分别用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-果糖、牛肉膏以及甘露醇为菌株生长提供碳源，并在实施例2～6已确定的最适发酵时间、温度、pH值、接种量和最佳转速条件下进行发酵，检测不同碳源对拮抗菌抑菌活性的影响，确定最佳碳源。

所得实验结果请参阅图6。由图6可得，在发酵培养基的碳源选自：牛肉膏、甘露醇以及D-果糖中的一种或多种时，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，当发酵培养基的碳源为牛肉膏时，抑菌活性最高。因此，最适宜的发酵培养基的碳源为牛肉膏。

实施例8

本实施例为检测在烟草赤星病拮抗菌，即芽孢杆菌的发酵方法中，发酵培养基的碳源对于拮抗菌抑菌率影响的具体实施例。

以氮源添加量为1％的比例，分别用蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏、草酸铵以及脲为菌株生长提供氮源，并在实施例2～7已确定的最适发酵时间、温度、pH值、接种量、转速和碳源条件下进行发酵，检测不同氮源对拮抗菌抑菌活性的影响，确定最佳氮源。

所得实验结果请参阅图7。由图7可得，在发酵培养基的氮源选自：蛋白胨、酵母浸膏以及胰蛋白胨中的一种或多种时，菌株的抑菌率都呈现在一个良好的抑菌状态；其中，当发酵培养基的氮源为蛋白胨时，抑菌活性最高。因此，最适宜的发酵培养基的氮源为蛋白胨。

综上所述，本发明提供了一种烟草赤星病拮抗菌的发酵方法，所述发酵方法为：所述烟草赤星病拮抗菌接种于发酵培养基中，振荡培养，得烟草赤星病拮抗菌；所述振荡培养的时间为72h。本发明还提供了一种上述发酵方法培育制得的烟草赤星病拮抗菌在烟草抗病领域的应用。经检测可得，本发明提供的技术方案培育得到的烟草赤星病拮抗菌，抑菌率显著提高，可用于烟草赤星病的防治。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。